Упрощённый способ качественного анализа смесей методом тонкослойной хроматографии

Оборудование: сосуд для собирания газов или кристаллизатор – 1 шт., эксикатор – 1 шт., пластинки для хроматографии, пинцет, химический стакан с капилляром для нанесения аминокислот на пластинку – 3 шт., ножницы, линейка, простой карандаш, тигельные щипцы.

Реактивы: 0,1% раствор нингидрина в ацетоне, растворы аминокислот (например, аланин, фенилаланин, аргинин), смесь «бутанол : уксусная ки­слота : вода» = 15:3:7.

Ход работы.На расстоянии 1,0 см от узкого края силуфоловой пластинки каранда­шом намечают четыре едва заметные точки старта и наносят в них с по­мощью капилляров растворы аминокислот (см. рис. 11). В капилляр набирают раствор аргинина и прикасаются им в первой точке и в последней. После того, как последняя точка высохнет, берут второй капилляр и набирают раствор аланина, прикасаются им во второй точке и в последней. В третий капил­ляр набирают раствор фенилаланина и прикасаются капилляром в третьей точке и в четвертой. В итоге в четвертой точке будет находиться смесь трёх аминокислот: аргинина, аланина и фенилаланина.

Пластинку с нанесенными растворами аминокислот помещают в экси­катор, погружая ее стартовым краем в проявитель (бутанол : уксусная ки­слота : вода = 15 : 3 : 7) на 0,5 см. Через 30-60 мин хроматограмму выни­мают, отмечают границу фронта проявителя, подсушивают в сушильном шкафу и кратковременно опускают в простоквашницу с раствором нингидрина в ацетоне, после чего выдерживают сначала на воздухе, а затем прогревают в сушильном шкафу при 130°С в течение 7-10 мин. Позиции аминокислот на хроматограмме выявляются в виде сине-фиолетовых пятен на светлом фоне.

Проявление хроматограммы основано на проведении химической реакции: нингидриновая реакция (реакция Руэманна): при нагревании раствора, содержащего белок с нингидрином (в 95%-ном растворе ацетона) в течение не­скольких минут. Развивается сине-фиолетовое окрашивание.

Расчёты. Идентификацию аминокислот можно осуществить по значению R_f (коэффициент подвижности по фронту проявителя). Для этого измеряют с точностью до миллиметра расстояние, пройденное проявите­лем от линии нанесения аминокислот до границы фронта проявителя. С такой же точностью измеряют расстояние от точки нанесения каждой аминокислоты на хроматограмму до центра цветного пятна, образовавше­гося в результате нингидриновой реакции. Путем деления величины пути, пройденного аминокислотой на хроматограмме, на величину пути, пройденного проявителем, находят значение коэффициента подвижности R_f каждой аминокислоты-свидетеля –

.

Такие же расчеты проводят с аминокислотами исследуемой смеси. Сопоставляя величины R_f аминокислот-свидетелей и аминокислот иссле­дуемой смеси, делают заключение о природе аминокислот в составе изу­чаемой смеси.

Рис. 11. Нанесение растворов аминокислот на хроматографическую пластинку:

1 – Линия старта; 2 – Точки нанесения аминокислот; 3 – Пластинка; 4 – Расстояние, пройденное аминокислотой (l); 5 – Расстояние, пройденное проявителем (l_о).