Аквапорины (белки водных каналов), их структура, принцип работы.

Молекулы воды могут преодолевать биологические мембраны двумя путями: через липидный бислой и через поры, образуемые специфическими белками — аквапоринами. Хотя молекула воды является диполем, она электронейтральна и вследствие этого может в отличие от ионов диффундировать через липидную фазу мембраны. Долгое время путь воды через липидный бислой рассматривался как единственный. Однако наличие в мембранах пор, пропускающих молекулы воды, стали предполагать начиная уже с 1960-х гг. Позднее существование таких пор было доказано, и они получили название водных каналов.

Одним из критериев участия водных каналов в транспорте воды является высокое отношение осмотического коэффициента водной проницаемости (Pj) к диффузионному коэффициенту водной проницаемости мембраны (Pd). Pj характеризует общую водную проницаемость мембраны, когда ток воды осуществляется как через водные каналы, так и через липидный бислой. Значение Распределяют при наложении на мембрану градиента водного потенциала (градиента осмотического или гидростатического давления). Pd характеризует проницаемость мембраны, связанную только с диффузией, т. е. с движением молекул воды, которое происходит даже в отсутствие градиента водного потенциала. Соответственно, его определяют в условиях, когда A*F на мембране равен нулю. Значения Pfi\Pd приблизительно равны, если транспорт воды осуществляется только через липидный бислой, что, в частности, наблюдается на искусственных липидных бислоях, а также на биологических мембранах, в которых водные каналы отсутствуют или инактивированы. Показано, что для ПМ клеток многих растений Pf намного превосходит Pd. Это свидетельствует об участии водных каналов в транспорте воды через эту мембрану.

В отличие от диффузионной водопроницаемости осмотическая водопроницаемость оказалась чувствительной к соединениям ртути. Последняя ковалентно связывает сульфгидрильные группы. Ингибирование транспорта воды соединениями ртути в условиях наложенного на мембрану A*F позволило предположить, что водные каналы образованы белками, содержащими остатки цистеина. Чувствительность транспорта воды к ртутьсодержащим соединениям используется в качестве другого критерия участия в нем водных каналов.

Еще одним критерием вовлечения водных каналов в транспорт воды является его низкая энергия активации (Еа 21 кДж/моль). В отличие от движения воды через каналы диффузия воды через липидный бислой характеризуется намного более высокими значениями энергии активации (Еа = 58 — 70 кДж/моль).

На основании вышеприведенных критериев исследователи пришли к выводу, что водные каналы отвечают за основной поток воды через мембраны.

Использование молекулярно-биологических подходов в исследованиях позволило идентифицировать белки водных каналов — аквапорины. Первым идентифицированным белком с выраженной водно-транспортной активностью был белок мембраны эритроцитов CHIP28 (channel-forming integral protein), переименованный затем в AQP1. На основании гомологии с AQP1 позже были идентифицированы аквапорины у представителей различных систематических групп, в частности у бактерий, грибов, растений и животных. В растительных клетках аквапорины обнаружены в плазматической мембране и тонопласте. Аквапорины ПМ входят в семейство интегральных белков PIP (plasma membrane intrinsic protein), аквапорины то но пласта — в семейство интегральных белков TIP (tonoplast intrinsic protein). Для многих идентифицированных на основании гомологии с AQP1 растительных белков была продемонстрирована водно-транспортная активность. С этой целью кДНК идентифицированных белков (предполагаемых аквапоринов) были транскрибированы in vitro. Полученная РНК была введена в ооциты африканской травяной лягушки Xenopus laevis. Через некоторое время, необходимое для синтеза белка и встраивания его в плазматическую мембрану, ооциты переносили на гипотонический раствор и регистрировали скорость их набухания (скорость входа воды). Набухание происходило значительно быстрее у ооцитов, ПМ которых содержала продукт внедренной РНК, свидетельствуя, что исследуемый белок является аквапорином. Такого рода доказательство наличия водно-транспортной активности было получено для гомологов AQP1 ПМ и тонопласта из арабидопсиса (Arabidopsis thaliand), растений табака (Nicotiana tabacum), хрустальной травки (Mesembryanthemum crystallinum), бобов (Vicia faba), подсолнечника (Helianthus annus), шпината (Spinaciaa oleracea) и кукурузы (Zea mays).

Молекулярная масса аквапоринов варьирует от 23 до 31 кДа. На рис. 5.5 представлена гипотетическая структура аквапорина, образующего канал в мембране.

Полипептидная цепь аквапорина 6 раз пересекает липидный бислой. Домены, погруженные в липидный бислой, гидрофобны и образуют а-спирали. С- и N-концы аквапоринов ПМ и тонопласта расположены с цитоплазматической стороны мембраны. Гидрофильные домены полипептидной цепи соединяют а-спирали. Между 2-й и 3-й, а также между 5-й и 6-й сс-спиралями гидрофильные домены включают небольшие гидрофобные петли. Последние, как и а-спирали, погружены в липидный бислой. Каждая из этих двух петель содержит высококонсервативный мотив Asp-Pro-Ala, так называемый NPA-бокс. Две петли, содержащие этот мотив, совмещаются в центре липидного бислоя и формируют две полусферические поры, которые вместе создают узкий водный канал. Полагают, что такого рода двухосевая симметрия обеспечивает ток воды через мембрану в обоих направлениях, в зависимости от направления градиента водного потенциала, а также отвечает за селективность водного канала по отношению к молекулам воды.

Содержание белков PIP- и TIP-семейств в мембранах растительных клеток сильно варьирует. Оно зависит от вида растения, ткани, условий водного режима и в некоторых случаях может достигать очень высоких значений. Было показано, например, что в плазматической мембране листьев шпината на долю белков PIP-семейства приходится до 20 % от общего содержания белков в этой мембране.

Аквапорины не только отвечают за быстрый транспорт воды через мембраны, но также дают организму возможность регулировать водные потоки как между клетками, так и внутри клеток. Эта регуляция осуществляется как путем изменения числа водных каналов в мембране, так и путем изменения их активности. Содержание водных каналов в мембране зависит от биосинтеза аквапоринов, который находится под контролем транскрипционных факторов. Регуляция активности уже сформированных водных каналов осуществляется путем фосфорилирования. Водная проводимость мембран меняется в онтогенезе, изменяя потоки воды в соответствии с запросами роста и развития растения. Установлено, что при росте, когда происходит растяжение клеток, активность генов TIP-семейства возрастает. Экспрессия генов тонопластных аквапоринов и повышение транспортной активности последних в условиях роста растяжением необходимы для обеспечения усиленного притока воды в вакуоли и поддержания тургора в клетках.

8.3. Транспорт воды по растению. Корень как основной орган поглощения воды.

Необходимость поглощать много воды вследствие интенсивного ее расходования приводит к тому, что растения формируют большую корневую систему.

Многочисленными исследованиями (В.Г. Ротмистров, А.Л. Модестов и др.) установлено, что общая поверхность корневых систем, как правило, в несколько раз превосходит поверхность наземных органов.

Вместе с тем установлено, что размеры корневой системы (число корней и корневых волосков, их поверхность и т.д.) связаны с видовыми особенностями растительного организма и зависят вместе с тем от условий его развития. Например, при благоприятных условиях одно растение озимой ржи ( по Дитмеру) формирует до 14 млн. шт. корней первого – четвертого порядков общей длиной в 600 км и поверхностью в 225 м2. Количество корневых волосков достигает 15 млрд. шт., а их общая площадь составляет 400 м2. Надземная часть одного растения содержит: 80 побегов, 450 листьев, общая площадь которых равна 4,5 м2. По нашим данным у однолетнего сеянца яблони сливолистной, имеющего один побег, число боковых корней достигает 15 тыс. шт.

Непрерывно ветвясь, корни способны проникать в мельчайшие поры и поглощать содержащуюся в почвенных частицах влагу, а также минеральные вещества (рис. 4.3).

Корни растут с большой скоростью. Например, основные тяжи (главный корень и корни первого порядка) кукурузы удлиняются за сутки до 3,5 – 4,0 см, яровой пшеницы

– на 2,0 – 2,5 см, ячменя – на 1,5 – 2,0 см. Естественно, что при громадном количестве корней в итоге получаются весьма большие суточные приросты корневых систем. За вегетацию, и об этом говорилось ранее, суммарная длина корневых систем достигает сотен метров.

Корневые системы большинства растений способны к повторному использованию влаги из одних и тех же горизонтов почвы. Приспособлением к этому является ярусность и их разновременное образование.

Поглотительная активность корней не остается постоянной в течение вегетации.

Так, у злаков (пшеница, ячмень) водопоглощение постепенно возрастает от всходов до цветения. Набольшей поглотительной активностью корни злаков обладают в межфазный период кущение – колошение. Водопоглотительная активность их заметно снижается в период налива и, по всей вероятности, достигает минимума в конце молочной спелости. В это же время прекращается рост корней.

Поглотительная активность неодинакова у различных корней. Наибольшей поглотительной активностью обладают основные тяжи корней, у злаков – зародышевые, колеоптильные, узловые. Ранее сформированные ярусы корней поглощают больше воды. С возрастанием порядка ветвления поглотительная активность корней понижается, т.е. чем дальше расположен корень от центральной оси, тем меньше его роль в снабжении растений водой.

Далеко не вся корневая система всасывает воду. Этой способностью обладают лишь молодые корневые окончания. Вода поглощается клетками зоны корневых волосков, а также зоны растяжения.