Другие механизмы репликации

Репликация у вирусов имеющих одноцепную ДНК имеет особенности. В клетке хозяина на такой молекуле, называемой (+) цепью синтезируется комплементарный ему (-) цепь, таким образом образуется двухцепочечная молекула ДНК. (-) цепь затем служит матрицей для синтеза новых (+) цепей, которые встраиваются в вирусные частицы. В процессе участвуют ферменты вирусов и ферменты клетки-хозяина.

Репликация РНК происходит у организмов, геном которых кодирует эта нуклеиновая кислота - некоторые типы вирусов и вироиды. Процесс происходит в клетках хозяина, которые были инфицированы этими организмами. При этом также синтезируются (-) цепи и РНК проходит двухцепную стадию.

Базисные термины и понятия: ведущая (лидирующая) цепь; вилка репликации; хеликаза; гираза; дестабилизирующие белки; ДНК-полимераза; дочерняя нить ДНК; комплементарность; лигаза; матричная (родительская) нить ДНК; матричный синтез; одноцепочечный участок ДНК; отстающая цепь; полимеризация; полуконсервативный принцип; реплика; репликация; репликон; РНК-праймаза; РНК-праймер (РНК-затравка); спирализация ДНК; топоизомераза; точка начала репликации; фрагмент Оказаки; экзонуклеазная активность; 3'-конец цепочки; 5'-конец цепочки, репарация ДНК.

Изменения структуры ДНК

Естественным процессом является метилирование ДНК, которое оказывает влияние на ее функциональную активность, т.е. транскрипцию генов. Так, участки гетерохроматина (отсутствие или низкий уровень транскрипции генов) коррелируют с метилированием цитозина. Например, метилирование цитозина с образованием 5-метилцитозина важно для инактивации Х-хромосомы.

Средний уровень метилирования отличается у разных организмов: у нематоды Caenorhabditis elegans метилирование цитозина не наблюдается, а у позвоночных обнаружен высокий уровень метилирования - до 1 %.

Несмотря на биологическую роль, 5-метилцитозин может спонтанно утрачивать аминную группу (деаминироваться), превращаясь в тимин, поэтому метилированные цитозины являются источником повышенного числа мутаций. Другие модификации оснований включают метилирование аденина у бактерий и гликозилирование урацила с образованием «J-основания» в кинетопластах.

Суперспирализация

До сих пор мы говорили о ДНК как о линейной двух-цепочечной молекуле. Однако ДНК может находиться в виде кольцевой молекулы или чего-то подобного. У мелких вирусов геном действительно представляет со­бой кольцевую ДНК, в которой обе цепи двойной спира­ли замкнуты в непрерывное кольцо. В бактериальном и эукариотическом геномах ДНК может находиться в ви­де больших петель. При этом важно следующее: каждая петля удерживается у основания таким образом, что опять не образуется свободных концов. Значе­ние этой формы двойной спирали состоит в том, что она накладывает дополнительные ограничения на структуру.

Если взяться за концы верёвки и начать скручивать их в разные стороны, она становится короче и на верёвке образуются «супервитки». Так же может быть суперскручена и ДНК. Если двухцепочечную ДНК скрутить вокруг оси двой­ной спирали, то образуются супервитки. В качестве аналогии обычно рассматривают полоску резины, скру­ченную вокруг своей оси и образующую напряженную структуру, в которой резиновая полоска (двойная спи­раль) местами образует крестообразные структуры. При этом возникают конформации, изображенные на (рис.). В таком скрученном состоянии структура остается только в том случае, если нет свободных концов и раскручивание невозможно.

В обычном состоянии цепочка ДНК делает один оборот на каждые 10,4 основания, но в суперскрученном состоянии спираль может быть свёрнута туже или расплетена. Выделяют два типа суперскручивания: положительное — в направлении нормальных витков, при котором основания расположены ближе друг к другу; и отрицательное — в противоположном направлении. В природе молекулы ДНК обычно находятся в отрицательном суперскручивании, которое вносится ферментами — топоизомеразами. Эти ферменты удаляют дополнительное скручивание, возникающее в ДНК в результате транскрипции и репликации.

Для резиновой полоски безразлично, в каком напра­влении мы ее закрутим с образованием супервитков. (Оба края резиновой полоски одинаковы.) Однако двойная спираль сама по себе является скрученной структурой (что видно из переплетения двух цепей), поэтому ее реакция на скручи­вание зависит от того, в какую сторону оно происходит.

Отрицательные супервитки закручивают ДНК вокруг ее оси против часовой стрелки в направлении, обратном правосторонней двойной спирали. Это в принципе озна­чает, что напряжение скручивания можно частично осла­бить, регулируя саму структуру двойной спирали. При этом может получиться форма с меньшим углом враще­ния на пару оснований, а местами может даже нарушить­ся спаривание оснований. ДНК с отрицательными супер­витками называют недокрученной (underwound). Крайним случаем служит локальный переход правосторонней спи­рали в левостороннюю.

Не следует забывать, что такие события не происхо­дят спонтанно в ДНК, а могут случаться только под влиянием внешних условий. Для простоты можно счи­тать, что в результате суперспирализации молекула при­обретает избыток энергии. Таким образом, если нужно произвести некоторые изменения в структуре ДНК, на­пример удержать какой-то участок в одноцепочечном со­стоянии в результате связывания его с белками или пере­вести его в какую-либо иную форму, например в Z-форму, на это потребуется меньше энергии, если ДНК находится в состоянии отрицательной суперспирали. Так, степень спирализации может влиять на равновесие между разными структурами. Действительно, было обнаружено, что отрицательно суперспирализованная ДНК проявляет склонность к изменениям такого рода. Крайним случаем раскручивания правосторонней двойной спирали является ее превращение в левостороннюю спираль. Именно это происходит при переходе В-формы в Z-форму. Отрицательно суперспирализованная ДНК более предрасположена к переходу в Z-форму, чем релаксированная ДНК.

А

Б В

Рис. При суперспирализации двуспиральная молекула ДНК закручивается сама на себя. Разделение оснований снимает отри­цательную суперспирализацию (сверхскручи­вание): А. От­рицательно суперспирализованная ДНК; Б. Кольцевая ДНК без суперспирализации; В. Отри­цательная суперспирализация может привести к разделению цепей.

Повреждение ДНК

ДНК может повреждаться разнообразными мутагенами, к которым относятся окисляющие и алкилирующие вещества, а также высокоэнергетическая электромагнитная радиация — ультрафиолетовое и рентгеновское излучение. Тип повреждения ДНК зависит от типа мутагена. Например, ультрафиолет повреждает ДНК путём образования в ней димеров тимина, которые возникают при образовании ковалентных связей между соседними основаниями.

Оксиданты, такие как свободные радикалы или перекись водорода, приводят к нескольким типам повреждения ДНК, включая модификации оснований, в особенности гуанозина, а также двухцепочечные разрывы в ДНК. По некоторым оценкам, в каждой клетке человека окисляющими соединениями ежедневно повреждается порядка 500 оснований. Среди разных типов повреждений наиболее опасные — это двухцепочечные разрывы, потому что они трудно репарируются и могут привести к потерям участков хромосом (делециям) и транслокациям.

Многие молекулы мутагенов вставляются (интеркалируют) между двумя соседними парами оснований (рис. ). Большинство этих соединений, например, этидий, даунорубицин, доксорубицин и талидомид имеют ароматическую структуру. Для того чтобы интеркалирующее соединение могло поместиться между основаниями, они должны разойтись, расплетая и нарушая структуру двойной спирали. Эти изменения в структуре ДНК мешают транскрипции и репликации, вызывая мутации. Поэтому интеркалирующие соединения часто являются канцерогенами, наиболее известные из которых — бензопирен, акридины, афлатоксин и бромистый этидий. Несмотря на эти негативные свойства, в силу их способности подавлять транскрипцию и репликацию ДНК, интеркалирующие соединения используются в химиотерапии для подавления быстро растущих клеток рака.

Интеркалированное химическое соединение, которое находится в середине спирали — бензопирен, основной мутаген табачного дыма.

Репарация ДНК

Высокая стабильность ДНК обеспечивается не только консервативностью её структуры и высокой точностью репликации, но и наличием в клетках всех живых организмов специальных систем репарации, устраняющих из ДНК возникающие в ней повреждения.

Действие различных химических веществ, ионизирующей радиации а также ультрафиолетового излучения может вызвать следующие нарушения структуры ДНК:

· повреждения одиночных оснований (дезаминирование, ведущее к превращению цитозина в урацил, аденина в гипоксантин; алкилирование оснований; включение аналогов оснований, инсерции и делеции нуклеотидов);

· повреждение пары оснований (образование тиминовых димеров);

· разрывы цепей (одиночные и двойные);

· образование перекрестных связей между основаниями, а также сшивок ДНК-белок.

Некоторые из указанных нарушений могут возникать и спонтанно, т.е. без участия каких-либо повреждающих факторов.

Любой тип повреждений ведет к нарушению вторичной структуры ДНК, что является причиной частичного или полного блокирования репликации. Такие нарушения конформации и служат мишенью для систем репарации. Процесс восстановления структуры ДНК основан на том, что генетическая информация представлена в ДНК двумя копиями – по одной в каждой из цепей двойной спирали. Благодаря этому повреждение в одной из цепей может быть удалено репарационным ферментом, а данный участок цепи ресинтезирован в своем нормальном виде за счет информации, содержащейся в неповрежденной цепи.

В настоящее время выявлены три основных механизма репарации ДНК: фотореактивация, эксцизионная и пострепликативная репарация. Последние два типа называются также темновой репарацией.

1.Фотореактивация заключается в расщеплении ферментом фотолиазой, активируемой видимым светом, тиминовых димеров, возникающих в ДНК под действием ультрафиолетового излучения.

2. Эксцизионная репарация (base excision repair, BER). Объектом BER служат неправильно спаренные, алкилированные, окисленные и тому подобное, основания. Известно, чтоза сутки в каждой клетке человека происходит не менее 10⁵ нуждающихся в коррекции модификаций оснований. Этот тип повреждений не вызывает серьезных изменений в структуре двойной спирали ДНК, приводящих к нарушению репликации ДНК и остановке клеточного цикла, но служит источником мутаций. Механизм BER, возможно, является наиболее древним и важным.

Эксцизионная репарация заключается в узнавании повреждения ДНК, вырезании поврежденного участка, ресинтезе ДНК по матрице интактной цепочки с восстановлением непрерывности цепи ДНК. Такой способ называют также репарацией по типу выщепления – замещения, или более образно механизм «режь – латай». Эксцизионная репарация представляет собой многоэтапный процесс и заключается в:

1) «узнавании» повреждения;

2) надрезании одной цепи ДНК вблизи повреждения (инцизии);

3) удалении поврежденного участка (эксцизии);

4) ресинтезе ДНК на месте удаленного участка;

5) восстановлении непрерывности репарируемой цепи за счет образования фосфодиэфирных связей между нуклеотидами (рис. ).

Первый этап распознавания поврежденных оснований в этой системе репарации осуществляют специальные белки – гликозилазы. Это высокоспецифические ферменты, гидролизующие N-гликозидную связь между сахарофосфатным остовом и поврежденным основанием. Репарация начинается с присоединения ДНК-N-гликозилазы к поврежденному основанию. Существует множество ДНК-N-гликозилаз, специфичных к разным модифицированным основаниям. Ферменты гидролитически расщепляют N-гликозидную связь между измененным основанием и дезоксирибозой, это приводит к образованию АП (апуринового-апиримидинового) сайта в цепи ДНК (первый этап). Репарация АП-сайта может происходить при участии только ДНК-инсертазы, которая присоединяет к дезоксирибозе основание в соответствии с правилом комплементарности. В этом случае нет необходимости разрезать цепь ДНК, вырезать неправильный нуклеотид и репарировать разрыв.

I. 5ꞌ 3ꞌ

3ꞌ 5ꞌ

II. 5ꞌ 3ꞌ

3ꞌ 5ꞌ

II. 5ꞌ 3ꞌ

3ꞌ 5ꞌ

IV. 5ꞌ---------------- 3ꞌ

3ꞌ 5ꞌ

V. 5ꞌ 3ꞌ

3ꞌ 5ꞌ

Рис. Схема эксцизионной репарации

При более сложных нарушениях структуры ДНК необходимо участие всего комплекса ферментов, участвующих в репарации (Рис. ): АП-эндонуклеаза распознает АП-сайт и разрезает возле него цепь ДНК (II этап). Как только в цепи возникает разрыв, в работу вступает АП-экзонуклеаза, которая удаляет фрагмент ДНК, содержащий ошибку (III этап). ДНК-полимераза b застраивает возникшую брешь по принципу комплементарности (IV этап). ДНК-лигаза соединяет 3ꞌ-конец вновь синтезированного фрагмента с основной цепью и завершает репарацию повреждения (V этап).

Пострепликативная репарация включается в тех случаях, когда эксцизионная не справляется с устранением всех повреждений ДНК до её репликации. В этом случае воспроизведение поврежденных молекул приводит к появлению ДНК с однонитевыми пробелами, а нативная структура восстанавливается при рекомбинации.

Врожденные дефекты системы репарации являются причиной таких наследственных заболеваний, как пигментная ксеродерма, атаксия-телеангиэктазия, трихотиодистрофия, прогерия.