СИНТЕЗ СОМАТОТРОПИНА
В ряду гормональных препаратов, получаемых биотехнологическими методами, особое место занимает соматропин – гормон роста человека (ГРЧ, рГРЧ). Нарушения роста у детей занимают третье место в структуре детской эндокринной патологии. Наиболее выраженные клинические проявления и тяжелый прогноз заболевания имеют дети, страдающие соматотропной недостаточностью.
Соматотропин (или гормон роста человека ГРЧ) секретируется передней долей гипофиза. Впервые он был выделен и очищен в 1963 г. из гипофиза. Его недостаток приводит к заболеванию - гипофизарной карликовости (1 случай на 5000 человек). Гормон обладает видовой специфичностью. Обычно его получают из гипофиза трупов, но в недостаточном количестве. Гормона хватает лишь для лечения 1/3 случаев гипофизарной карликовости в развитых странах. Основные производители - Швеция, Италия, Швейцария и США. Молекула ГРЧ состоит из 191 аминокислотного остатка.
Препарат из трупного материала представляет собой смесь из нескольких форм, из которых пять имеют молекулярную массу 22 кДа, другие являются димерами, а остальные - фрагментами, образующимися при протеолизе. Это приводило к тому, что у 30 % больных, получавших препарат, против гормона вырабатывались антитела, сводившие на нет его биологическую активность.
Определение аминокислотной последовательности ГРЧ и клонирование его гена позволило уже в начале 80-х годов ХХ века получить первые препараты рекомбинантного ГРЧ (рГРЧ) для применения в медицинской практике.
Будучи синтезированным в клетках Е. coli, ГРЧ содержит дополнительный остаток метионина на H2N-концe молекулы. Биосинтез ГРЧ из 191 аминокислотного остатка был осуществлен в 1979 г. Д.Гедделем с сотрудниками. Сначала клонировали двунитевую кДНК; далее путем расщепления получали последовательность, кодирующую аминокислотный порядок гормона, за исключением первых 23 аминокислот, - с фен (—NH2) до лей (23), и синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от первой до двадцать третьей со стартовым ATG-кодоном в начале. Затем два фрагмента объединяли и подстраивали к паре lac-промоторов и участку связывания рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры, что составляет 100 000 молекул гормона на клетку. Полученный гормон на конце полипептидной цепи содержал дополнительный остаток метионина и обладал значительной био-
логической активностью. С 1984 г. после серьезных клинических испытаний на токсичность компанией «Генетех» (Сан-Франциско, США) было начато широкомасштабное производство бактериального соматотропина.
ГРЧ в клетках Е. coliи в культуре клеток животных был получен в 1982 г. одновременно в Институте Пастера (Париж) и в Институте молекулярной биологии (Москва). Оказалось, что в бактериальных клетках возможен синтез аналогов ГРЧ, с помощью которых изучались участки молекулы, важные для стимулирования роста и процесса неоглюкогенеза на молекулярном уровне.
Огромный интерес представляют выделение и синтез полипептида, обладающего полной биологической активностью гипоталамического рилизинг-фактора соматотропина(СТГ-РФ). Введение этого фактора способно компенсировать недостаток соматотропина. Таким образом, наличие СТГ-РФ и самого гормона, полученных в генетически сконструированных бактериальных клетках, очень важно для успешного лечения заболеваний, обусловленных недостатком этого гормона, и ряда патологических заболеваний, таких, как некоторые формы диабета, регенерация тканей после ожогов и др. Предполагается, что СТГ-РФ можно использовать и для увеличения массы и роста домашних животных, так как он, не обладая видовой специфичностью, способен стимулировать освобождение гормона роста у ряда животных.
4. β-Эндорфин
β-Эндорфин - опиат мозга, состоящий из 31 аминокислотного остатка, был синтезирован в генетически сконструированных клетках в 1980 г. группой ученых из Австралии и США. β-Эндорфин получен в клетках Е. coliв виде гибридного белка с β-галактозидазой. Процедура синтеза β-эндорфина включала: получение путем обратной транскрипции мРНК - кДНК, кодирующей белок-предшест-венник, содержащий помимо последовательности β-эндорфина последователь-ность АКТГ и (β-липотропина (β-ЛТТ), в дальнейшем удаляемые. (β-Эндорфин, полученный из гибридного белка и тщательно очищенный, обладал значительной биологической активностью. Он специфически взаимодействовал с антисывороткой против β-эндорфина. От β-эндорфина человека генно-инженерный β-эндорфин отличался по двум аминокислотам, и эти отличия можно было легко устранить на нуклеотидном уровне путем замены двух кодонов в ДНК бактериальной плазмиды.
В 1978 г. сотрудниками Института биоорганической химии под руководством акад. Ю. А. Овчинникова был осуществлен синтез двух структур-ных генов, кодирующих синтез нейропептидов: лейцин-энкефалина и брадикинина.
Иммуномодуляторы
Иммуномодуляторы - это природные или синтетические препараты, способные оказывать регулирующее действие на функции иммунной системы; кроме того, их влияние распространяется на другие системы организма: сосудистую, нервную, эндокринную, кроветворную.
Иммуномодуляторы синтезируются клетками организма (цитокины, гормоны, биологически активные пептиды), их также получают путем биосинтеза или химического синтеза и применяют в качестве лечебных и профилактических средств при различных заболеваниях и трансплантации.
Интерлейкины получают, используя в качестве продуцентов культуры нормальных лимфоцитов или макрофагов, культуры Т-клеточных гибридов и рекомбинантные клетки микроорганизмов. Т-клеточные гибридомы -это продукты слияния Т-лимфоцитов, продуцирующих определенный интерлейкин, и опухолевых клеток, способных к неограниченному росту. В качестве рекомбинантных продуцентов используют Е. coli, Saccharomyces cerevisiae и другие микроорганизмы, в геном которых методами генетической инженерии введены гены, контролирующие синтез интерлейкина (ИЛ-1, ИЛ-2).
Колониеспшмулирующие факторы (КСФ) - это разновидность цитокинов с преимущественным действием на гемпоэз, служат факторами выживаемости и роста кроветворных предшественников. Рекомбинантные препараты КСФ (лейкомакс, молграстим, лейкоген, ленограстим) используют для нормализации подавленного гемопоэза и активации иммунной системы, в частности, на фоне цитотоксической терапии опухолей и индуцированной иммунодепрессии при трансплантации.
Среди цитокинов ранее всего в медицинскую практику вошли препараты интерферона, которые используют при вирусных и некоторых злокачественных заболеваниях.
Интерфероны (ИФН) - это группа белков и гликопротеинов, каждый из которых синтезируется определенными клетками организма и выполняет специфические функции. Известно около 20 природных ИФН, различающихся по структуре и биологическим свойствам: α-ИФН состоит из 12 подвидов, β-ИФН - из 3-4 подвидов, γ-ИФН - из 2-3 подвидов. Рекомбинантные ИФН также имеют разновидности.
Продуцентом α-ИФНявляются лейкоциты периферической крови человека, которые культивируют на специальной среде в присутствии вируса -интерфероногена. Нативный ИФН выделяют из культуральной жидкости осаждением и хроматографией. Метод имеет ограниченное применение из-за необходимости использования большего количества донорской крови.
β-ИФНсинтезируется в культуре фибробластов (клеток соединительной ткани человека) в присутствии в качестве интерфероногена двухцепочечной РНК.
γ-ИФИ- в культуре иммунных Т- или В-лимфоцитов, в том и другом случае с низким выходом, поэтому производство с использованием культур клеток человека - процесс дорогостоящий. Экономически оправдано получение ИФН с использованием рекомбинантных культур микроорганизмов: Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Saccharomyces cerevisiae. Очистку ИФН проводят методом аффинной хроматографии с использованием моноклональных антител.
Технологическая схема получения генно-инженерных интерферонов (как одна из возможных) принципиально сводится к следующему:
1. индукция синтеза и выделение интерфероновой мРНК из клеток,
2. получение кДНК, комплементарной интерфероновой мРНК из
лейкоцитов,
3. встраивание кДНК в плазмиду,
4. введение реконструированной плазмиды в клетки Е. coli,
5. размножение бактерий, содержащих реконструированную плазмиду, в
культуральной среде,
6. сепарирование клеток Е. coli,
7. дезинтеграция и экстракция клеток Е. coli,
8. осаждение (например, полиэтиленамином) с последующим центрифуги-
ованием,
9. высаливание интерферона из супернатанта сульфатом аммония
10. диализ осадка интерферона,
11. растворение интерферона, пропускание раствора через колонку с имму-
носорбентом (пришитыми моноклональными антителами),
12. элюция интерферона с последующей хроматографией на целлюлозном
катионообменнике.
Дата добавления: 2017-01-26; просмотров: 2485;