Определение жизнеспособности патогена

При определении количества жизнеспособных спор, образовавшихся на поверхности пораженных органов, а также анализе популяции патогена пользуются методом рассева определенного объема суспензии инокулюма определенного объема суспензии инокулюма на агаровой среде. Такую среду готовят из экстракта поражаемых тканей растения-хозяина.

Для приготовления суспензии на 25 мл стерильной воды берут 10 проб и 10 типично пораженных органов общей площадью в 1 см² Вырезанные кусочки пораженных тканей помещают в колбу со стерильной водой и тщательно встряхивают. Полученную суспензию сливают в чистую колбу, откуда берут по 0,1 мл для рассева на агаризованную среду, разлитую в чашки Петри. Суспензию наносят на поверхность среды стерильной пипеткой в виде капель и равномерно распределяют с помощью простерилизованного шпателя.

В качестве шпателя используют согнутую стеклянную палочку или пипетку с предварительно запаянным концом. Их стерилизуют сухим жаром и используют только один раз. Возможно и многократное использование шпателя со стерилизацией после каждого рассева в кипящей воде или над пламенем.

Перед посевом определяют количество спор, находящихся в одной капле приготовленной суспензии. Для этого при малом увеличении микроскопа подсчитывают число спор в 10 каплях и рассчитывают среднее арифметическое. Желательно, чтобы споры распределялись в суспензии равномерно и в каждой капле их количество было примерно одинаково. Если это условие не соблюдается, суспензию следует дополнительно перемешать. Среднее число спор в капле от 25 до 50 следует считать оптимальным, поскольку при высокой плотности посева создаются трудности в подсчете колоний. Уменьшение количества спор в одной капле достигается добавлением в суспензию пропорционального количества стерильной воды.

После рассева чашки Петри инкубируют при оптимальной для данного вида гриба температуре. Колонии подсчитывают как только они станут хорошо видны невооруженным глазом; наблюдения ведут на 10 чашках.

Довольно часто суспензии грибов, взятых из природного материала, оказываются сильно загрязненными эпифитной микрофлорой. Поэтому весьма затруднителен подсчет развившихся колоний на твердых питательных средах. В этом случае жизнеспособные споры учитывают по энергии их прорастания в 2-3 каплях стерильной воды с кусочками восприимчивой ткани растения-хозяина. Кусочек размером 2-3 мм в диаметре вырезают препаровальной иглой. Капли помещают во влажные камеры, приготовленные из колец Ван Тигема. Для этого необходимы простерилизованные кольца, предметные и покровные стекла. Кольца прикрепляют к предметным стеклам вазелином, которым смазывают также и их верхнюю часть; на дно кольца помещают каплю стерильной воды. Затем на нижнюю сторону покровного стекла наносят каплю суспензии, в которую кладут кусочек ткани, вырезанной из тщательно промытого в воде восприимчивого органа, питающего гриб растения. После этого стекло прижимают к кольцу. Наблюдения проводят при оптимальной температуре для прорастания спор изучаемого патогена через 6 или 9 ч после закладки опыта. Проросшими считают те споры, ростковые гифы которых превышают их длину. Преимущество этого метода заключается в том, что имеется возможность вести наблюдения под большим увеличением микроскопа.

При отсутствии колец Ван Тигема или необходимости проведения быстрого анализа жизнеспособности спор, когда их размеры позволяют проводить подсчеты при малом увеличении микроскопа, их проращивают в каплях на предметных стеклах. Последние помещают на небольших подставках во влажные камеры, приготовленные в чашках Петри по обычному способу. Точность подсчета общего числа проросших спор определяют по описанной ранее методике.

Задание: