Как должна выглядеть гистограмма с правильно настроенным напряжение при помощи изотипического контроля?

1 2 34

Следует помнить про то, что негативные клетки должны попадать в первую декаду на логарифмической шкале интенсивности флюоресценции по всем задействованным каналам. Необходимо добиться того, чтобы клетки контроля легли, по возможности, в центре первой декады, при этом во вторую декаду должно попадать не более 2% клеток. Рассмотрим примеры корректной и не корректной настройки изотипичского контроля по FITC:

	Напряжение очень низкое! Часть пика «прилипает» к началу координат. Необходимо повысить напряжение по FL1. В противном случае при анализе образцов Вы не сможете корректно настроить параметры цветовой компенсации, кроме того, очень велик риск получить некорректный результат при анализе маркеров с низким уровнем экспрессии.
	Напряжение оптимально, Пик виден целиком. В зону позитивных клеток попадает чуть менее 1% клеток.
	Напряжение высокое – за пределами первой декады находится более 2% клеток. Необходимо понизить напряжение по FL1. В противном случае при анализе образцов Вы получите ложно позитивные результаты.

Итак, Вы корректно выставляете напряжение по FL1, при этом на напряжение по остальным каналам флуоресценции Вы не обращаете внимание. У Вас дожна получиться подобная картинка:

Как только параметры напряжения по прямому, боковому светорассеянию и по FL1 у Вас оптимизированы, то нажатием левой клавиши мыши Вам необходимо убрать галочку напротив “Setup Mode” ” в окне “Cytometer Control”, Прибор после этого наберет необходимое число событий (5000 по гистограмме FL1), автоматически сохранит результаты анализа и перейдет к пробирке 2, в которой у Вас находится изотипический контроль для настройки второго канала флуоресценции FL2. При этом, как уже отмечалось выше, все сделанные Вами изменения в настройках автоматически перенесутся на данную пробирку.

При анализе второй пробирки оптимизируйте настройки напряжения по FL2 описанным выше способом. Для начала нажатием левой клавиши мыши верните на место галочку напротив “Setup Mode” ” в окне “Cytometer Control”. И продолжите настройку напряжения по каналу FL2. Необходимо помнить, что в пробирке 2 у Вас клетки окрашены антителами, конъюгированными только с РЕ!

!!! При анализе второй пробирке Вы оптимизируете настройки ТОЛЬКО по каналу FL2. Настройки остальных каналов Вы НЕ ИЗМЕНЯЕТЕ !!!

По завершении настройки нажатием левой клавиши мыши Вам необходимо убрать галочку напротив “Setup Mode” ” в окне “Cytometer Control”, Прибор после этого наберет необходимое число событий (5000 по гистограмме FL1), автоматически сохранит результаты анализа и перейдет к пробирке 3, в которой у Вас находится изотипический контроль для настройки второго канала флуоресценции FL3. При этом, как уже отмечалось выше, все сделанные Вами изменения в настройках автоматически перенесутся на данную пробирку.

Аналогично проделайте для пробирок 3 и 4, где у Вас находятся клетки, окрашенные изотипическими контролями по ECD и РС5.

!!! При анализе третьей пробирке Вы оптимизируете настройки ТОЛЬКО по каналу FL3. Настройки остальных каналов Вы НЕ ИЗМЕНЯЕТЕ !!!

!!! При анализе четвертой пробирке Вы оптимизируете настройки ТОЛЬКО по каналу FL4. Настройки остальных каналов Вы НЕ ИЗМЕНЯЕТЕ !!!

Итак, Вы настроили четыре канала флуоресценции по соответствующим изотипическим контролям. После завершения сбора данных по четвертой пробирке, где у Вас находился изотипический контроля по FL4. По завершении настройки этой пробирки все изменения в проколе необходимо сохранить. Для этого левой клавишей мыши следует нажать на клавишу “Save Protocol” в левой верхней части экрана.

Как только прибор перешел к анализу пятой пробирке, в которой у Вас находятся частицы Flow-Set Pro, то Вам необходимо:

1. создать две однопараметрические гистограммы – по FS и SS, как это Вы делали при создании протокола (гистограммы не стоит гейтировать, сверху в них должно быть написано “Ungated”);

2. понизить дискриминатор (графа “Discr.” напротив “FS” в онке “Cytometer Control”) до 30 единиц по FS (флуоросферы Flow-Set Pro имеют очень небольшой размер);

3. не ставя галочки напротив “Setup Mode” в окне “Cytometer Control” проанализировать 10000 событий и нажать клавишу “Stop”

4. Если Вы правильно понизили дискриминатор, то в самом начале координат на однопараметрической гистограмме по FS Вы увидите очень узкий пик частиц почти в самом начале координат (на гистограммах по FL1, FL2, FL3 и FL4 Вы не увидите событий, так как на них отображаются событий из области “A”, в которую из-за небольшого размера флуоросферы Flow-Set Pro не попадают!). Ваше рабочее пространство имеет следующий вид:

5. Теперь Вам необходимо создать новый линейный регион (в нашем случае регион “F”) на однопараметрической гистограмме по FS, как это Вы делали при создании регионов для настройки протокола по изотипическим контролям, и зайти в свойства этой гистограммы. При этом пик частиц необходимо охватить очень плотно, чтобы дуплеты (следующий маленький пик) не попадали в данную область. Чтобы уменьшить число дуплетов перед началом работы флакон с флуоросферами Flow-Set Pro необходимо тщательно перемешать!!!

Для этого нажатием правой кнопки мыши на гистограмме вызовите диалоговое окно (действие 1), в котором нажатием левой кнопки мыши выберите раздел “Format Plot” (действие 2).

После выбора раздела “Format Plot” у Вас появится окно “Histogram Plot Properties”.

В графе “Gate”, нажав левой кнопкой мыши по указанному на рисунке месту (действие 1), и выберите из списка доступных регионов регион “F” (или тот регион, в который у Вас попадает пик частиц Flow-Set Pro по гистограмме FS) и нажмите на его названии левой клавишей мыши (действие 2).

Тем самым, на данной гистограмме у Вас буду отображаться события, попадающие только в регион “F”, однако этот регион можно применить и ко всем остальным гистограммам, так как в данном случае Вас интересует только флуоресценция этих частиц и ничего более. Для этого Вам необходимо поставить галочку напротив графы “Apply gate to all plots” нажатием левой клавиши мыши , как это показано на рисунке.

… и нажать клавишу .

После этого на всех гистограммах Вашего протокола будут отображать только значения, полученные для флуоросфер Flow-Set Pro (в данном случае – частицы выделены синим цветом на всех гистограммах).

Величина, необходимая Вам для дальнейшей настройки протокола – это “X-mean” или средняя интенсивность флуоресценции. В данном случае Вам необходимо «перевести» язык изотипических контролей (их среднюю флуоресценцию – собственно, то ради чего Вы и настраивали изотипические контроли – чтобы знать фон или флуоресценцию негативных – неокрашенных специфическими антителами – клеток) на язык, понятный прибору, то есть на среднюю флуоресценцию флуоросфер Flow-Set Pro при ВАШИХ НАСТРОЙКАХ НАПРЯЖЕНИЯ!!! Эти величины необходимо записать для всех настроенных Вами каналов, то есть прямого (FS) и бокового (SS) светорассеяния, а также каналов флуоресценции - по FL1, FL2, FL3 и FL4. Как это сделать?

Для начало необходимо войти в окно статистики - кнопка “Select Result” – и нажать на нее левой клавишей мыши .

После этого у Вас появится окно, где в разделе “Statistic Type” синим отмечены статистические данные, которые прибор выдает «по умолчанию» для проанализированных событий. В данном случае Вас интересует только “X-Mean”, а все остальные графы можно инактивировать нажатием левой клавиши мыши , как это показано на рисунке.

После этих манипуляций подсвеченной синим у Вас должна остаться только строчка “X-Mean”. По завершении – нажмите клавишу .

Теперь Вам необходимо записать значения X-MeanпоFS, SS, FL1, FL2, FL3 и FL4 на листок бумаги. Для этого Вам необходимо открыть раздел статистики на всех однопараметрических гистограммах. Наведите курсор мыши на нижний левый угол для начала гистограммы FL1, курсор мыши приобретет у Вас вид Σ, и нажмите левую клавишу мыши , как это показано на рисунке. И у Вас под гистограммой появится окошко со статистикой.