Устройство биологического микроскопа

Микроскоп (от греческого слова micros - малый, scopeo - смотрю) состоит из двух частей: механической и оптической (рис. 1.1).

Механическая часть микроскопа включает подковообразное основание 12, тубусодерлатель 8, тубус 7 и предметный столик 3. Подковообразное основание служит опорой микроскопу. Предметный столик служит для размещения на нем исследуемого предмета (препарата). На поверхности столика имеются две клеммы, служащие для закрепления препарата. В центре предметного столика находится отверстие для прохождения лучей света, освещающих препарат. Предметный столик может перемещаться в горизонтальной плоскости на 8 мм с помощью двух винтов 9, находящихся справа и слева.

Столик может вращаться и вокруг своей оси. Вместе со столиком передвигается и препарат, что дает возможность привести любую точку препарата в центр поля зрения.

Тубусодержатель имеет форму дуги и может перемещаться на 50 мм с помощью механизма, смонтированного в основании. Этот механизм приводится в действие вращением макрометрического 10 и микрометрического 11 винтов, предназначенных для грубой и тонкой фокусировки препарата. При вращении винтов по часовой стрелке тубусодержатель микроскопа опускается, при вращении против часовой стрелки - поднимается. Один оборот микрометрического винта соответствует перемещению тубуса на 0,1 мм.

В верхней части тубусодержателя находится вращающийся вокруг своей оси револьвер 5, в отверстия которого ввинчиваются объективы 4 и гнездо для крепления наклонного или прямого тубуса 7. Наклонный тубус можно повернуть вокруг вертикальной оси в любое удобное положение и закрепить винтом. В тубусе заключена вся увеличительная оптика микроскопа. В верхний конец тубуса вставлен окуляр 6. Некоторые модели микроскопов имеют бинокулярный тубус.

Рис. 1.1 - Микроскоп биологический:

1 – зеркало; 2 – конденсор; 3 - предметный столик; 4 – объектив; 5 – револьвер; 6 – окуляр; 7 – тубус; 8 – тубусодержатель; 9 - винт для перемещения предметного столика; 10 - макрометрический винт; 11 - микрометрический винт; 12 - подковообразное основание микроскопа

Оптическая часть микроскопа включает: осветительный аппарат, объективы и окуляр.

Осветительный аппарат состоит из зеркала 1 и конденсора 2 и предназначен для наилучшего освещения препарата. Регулируемое зеркало укреплено у основания штатива и имеет две стороны: вогнутую и плоскую. Вогнутое зеркало собирает и концентрирует в плоскости препарата пучок лучей, идущих от источника света, поэтому чаще всего им пользуются в тех случаях, когда работают без конденсора или при слабом освещении. При достаточном освещении и наличии конденсора пользуются плоской поверхностью зеркала. Для освещения объектов рекомендуется применять специальные осветители.

Конденсор укреплен над зеркалом и состоит из нескольких линз. Он предназначен для собирания параллельных лучей света, идущих от источника света и отраженных зеркалом в одной точке-фокусе, который должен находиться в плоскости препарата. С помощью винта конденсор можно передвигать вверх и вниз. Обычно при работе с малым увеличением конденсор опускают, а при работе с большим увеличением конденсор поднимают. В конденсор вмонтирована ирисовая диафрагма, позволяющая задерживать излишние лучи света и регулировать апертуру (см.ниже) конденсора. Под конденсором находится откидная оправа для светофильтра.

Объектив представляет собой наиболее важную часть микроскопа. Объектив состоит из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Самая главная - наружная (фронтальная) линза, от фокусного расстояния которой зависит увеличение объектива. Чем больше кривизна фронтальной линзы, тем короче фокусное расстояние и тем больше увеличение объектива. Увеличение объектива всегда обозначено на его оправе. Микроскоп МБР-1 имеет объективы, увеличивающие в 8, 40 (сухие) и 90 (иммерсионный) раз. От увеличения объектива зависит ещё одна характеристика микроскопа - его рабочее расстояние, то есть расстояние от фронтальной линзы до плоскости препарата при сфокусированном объекте. Чем большее увеличение дает объектив, тем ниже следует опускать его над плоскостью препарата.

Выше фронтальной линзы в объективе расположены коррекционные линзы, предназначенные для получения более четкого изображения. Как известно, изображение, полученное при помощи линз, обладает рядом недостатков - аберрации. Первая проявляется в невозможности одновременной фокусировки всего поля зрения, вторая связана с тем, что получаемое изображение приобретает окраску, которую не имеет объект. Объективы, у которых сферическая и хроматическая аберрации скоррегированы не полностью, называются ахроматы. Они содержат до шести линз и дают изображение наиболее резкое в центре. Края поля зрения при использовании ахроматов бывают окрашены в разные цвета спектра. Ахроматы широко распространены вследствие своей простоты и дешевизны. Микроскопы системы МБР снабжены ахроматическими объективами.

Более совершенные объективы - апохроматы - состоят из 10, а иногда из 12 линз. Хроматическая погрешность в них почти в 10 раз меньше, чем у ахроматов. Кроме того, апохроматы обеспечивают более равномерную резкость изображения. На их оправе имеется обозначение «Апохр». Планахроматы полностью устраняют искривление поля зрения, вплоть до краев. Эти объективы применяют главным образом при микрофотографировании.

Окуляр содержит две линзы - глазную (верхнюю) и собирательную (нижнюю) и служит для рассмотрения изображения предмета, даваемого объективом, т.е. выполняет роль лупы. Окуляры могут давать увеличение в 5, 7, 10, 12, 15, 20 раз, что указано на их оправе, например 15х. Общее увеличение окуляра повышается с увеличением фокусного расстояния линз, его составляющих, поэтому более сильные окуляры будут короткими, а более слабые - длинными.

Специальные, так называемые компенсационные окуляры, употребляются только с апохроматами. Они сконструированы таким образом, что дают хроматическую ошибку, обратную остаточному хроматизму апохромата и поэтому её компенсирующую. В результате получается правильно скоррегированное изображение объекта. На оправе компенсационных окуляров имеется обозначение «Комп».

Объектив и окуляр дают изображение, увеличенное в той или иной степени. Увеличение, которое даёт микроскоп, определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. Так, например, использование окуляра 15х и объектива 90х позволяет увеличить объект в 1350 раз. Однако общее увеличение ещё не характеризует всех возможностей микроскопа. Увеличенное изображение может быть как четким, так и нечетким.

Отчетливость получаемого изображения определяется разрешающей способностью микроскопа. Под разрешающей способностью микроскопа понимают минимальное расстояние между двумя точками, когда они ещё не сливаются в одну. Таким образом, чем больше разрешающая способность микроскопа, тем меньшей величины можно увидеть объект.

Величина разрешающей способности микроскопа зависит от длины волны используемого света и суммы числовых апертур объектива и конденсора, и вычисляется по формуле

d = λ / (А₁+А₂), (1.1)

где d - минимальное расстояние между двумя точками;

λ - длина волны используемого света;

А₁ - числовая апертура объектива;

А₂ - числовая апертура конденсора.

Числовая апертура определяется произведением синуса половины отверстного угла (u) на показатель преломления (n) среды, граничащей с объективом (рис. 1.2).

А = n·sin u (1.2)

Рис. 1.2 - Схема прохождения лучей света:

В – объект; О – объектив; u - половина отверстного угла

Иными словами, числовая апертура - это оптический «охват» линзы, она является мерой количества света, попадающего в линзу. Использование объективов с большой апертурой и коротковолнового света позволяет увидеть структурную организацию клетки.

Числовая апертура любой линзы, граничащей с воздухом, не может быть больше единицы, так как показатель преломления воздуха равен единице, а угол u (см. рис. 1.2) не может быть больше 90° (т.е. sin u < 1). Повысить разрешающую способность можно двумя путями: либо освещать объект короткими лучами света, например, ультрафиолетом, что требует применения дорогостоящей кварцевой оптики, либо увеличивать показатель преломления среды, граничащей с линзой объектива, с тем, чтобы приблизить его к показателю преломления стекла, на котором находится объект (n_стекла = 1,5).

Для этого между фронтальной линзой объектива и исследуемым объектом помещают каплю жидкости с показателем преломления большим, чем показатель преломления воздуха, например, каплю воды (n = 1,3), глицерина (n = 1,4) или кедрового (иммерсионного) масла (n = 1,5). Для каждой указанной жидкости выпускаются специальные объективы, которые называются иммерсионными. Числовая апертура этих объективов возрастает благодаря увеличению как значения n, так и sin u.

Пользуясь биологическим микроскопом, можно рассмотреть объект размером не менее 0,2 мкм.

Величина числовой апертуры каждого объектива указывается на его оправе. Сухие системы МБР-1 - 8х и 40х - имеют апертуру 0,2 и 0,65 соответственно. Иммерсионный объектив 90х имеет апертуру 1,25. На оправе этого объектива нанесено также обозначение «МИ» - масляная иммерсия и черное кольцо.

Таким образом, микроскоп имеет две характеристики: увеличение и разрешающую способность. Разрешающая способность определяет отчетливость получаемого изображения, а увеличение - это получение изображения, увеличенного в той или в иной степени. Повышение увеличения с помощью более сильного окуляра не улучшает разрешения, так как окуляр не может изменить качества получаемого изображения; последнее зависит от объектива. Поэтому лучше использовать объектив с большим увеличением, и окуляр с меньшим увеличением, чем наоборот.

Произвольное обращение с ирисовой диафрагмой конденсора, необоснованное поднимание и опускание конденсора приводит к резкому ухудшению качества изображения, а иногда и к искажению микроскопической картины.

Кроме светопольной микроскопии, с помощью биологического микроскопа для улучшения изображения, расширения границ видимости применяют и другие методы микроскопирования. Чтобы изображение было рельефно- объемным, стереоскопическим, предмет необходимо рассматривать одновременно двумя глазами. Для этой цели применяют специальный бинокулярный микроскоп с парными окулярами.

Широкое распространение в специальных методах исследования получили фазово-контрастная, люминесцентная и электронная микроскопия, а также микроскопия в темном поле.