ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ

Генетическая инженерия - конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ. Генная инженерия растений позволяет целенаправленно, по заранее намеченной программе, экспериментально модифицировать геном растений внесением отдельных новых генов. Методами генетической инженерии нужные гены можно изолировать (клонировать) и целенаправленно переносить в клетки организма-реципиента.

Если традиционные методы селекции позволяют объединять в геноме гибридов генетическую информацию из близкородственных, скрещивающихся между собой, видов растений, то разработанные к настоящему времени генно-инженерные методы и подходы дают возможность перестраивать геном растения с использованием генетической информации из разных гетерологических систем: вирусов, бактерий, насекомых, животных и человека. Более того, при использовании генно-инженерных методов существенно расширяются возможности модификации генома и внутри растительного царства, снимающие естественные барьеры между отдаленными видами растений. В этом случае становится возможным переносить отдельные гены между систематически удаленными видами, например, из однодольных в геном двудольных растений.

Современные технологии создания трансгенных растений включают несколько основных этапов:

— выделение и клонирование генов, представляющих интерес для дальнейшего переноса в растительный геном, и создание генетических конструкций для экспрессии трансгенов в растениях;

— перенос созданных генетических конструкций в геном растений;

— оценка трансгенных растений по стабильности экспрессии перенесенных генов и отбор отдельных трансформантов для дальнейшей селекционной доработки и оценка их биобезопасности.

(Термины: клонирование – создание множества копий гена; экспрессия – работа гена, проявление активности гена, синтез под контролем гена белкового продукта).

Известно, что у бактерий гены располагаются не только в хромосоме, но и в плазмидах, представляющих собой небольшие кольцевые молекулы ДНК. Генные инженеры обрабатывают выделенные плазмиды специальными ферментами (рестриктазами), представляющими собой «молекулярные ножницы», разрезающие плазмидную ДНК на отдельные фрагменты, среди которых присутствует и фрагмент, включающий искомый ген. Фрагмент с искомым геном переносится в плазмиду кишечной палочки, так как именно в ней можно достаточно быстро получить много копий данного гена. Наработанные копии клонированного гена используются для создания генетических конструкций для экспрессии в клетках растений.

В общем виде генетические конструкции, создаваемые для планируемого переноса в геном растений различных генов, включают следующие необходимые элементы:

· белок-кодирующую структурную последовательность (целевой ген);

· промотор, узнаваемый РНК-полимеразой растительной клетки;

· терминатор, узнаваемый РНК-полимеразой растительной клетки;

· селективный или маркерный ген для отбора трансформантов в селективных условиях.

Основными элементами генетических конструкций являются непосредственно сами целевые гены, представляющие собой белок-кодирующие последовательности генов различного происхождения, а также их регуляторные элементы — промоторы.

В качестве регуляторных элементов в генетической инженерии растений в настоящее время используются три вида промоторов: конститутивные, тканеспецифичные и индуцибельные.

Конститутивные промоторы, среди которых наиболее широко применяется промотор гена 35S-белка вируса мозаики цветной капусты, активны во всех тканях растения на протяжении всего жизненного цикла его развития.

Активность тканеспецифичных промоторов ограничивается функционированием генов в какой-либо определенной ткани растения. Например, промоторы генов запасных белков, таких как глютелин риса, легумин-B4 бобовых, напин капусты и γ-кафирин сорго ограничивают экспрессию трансгена в запасных тканях семян. Промотор гена пататина В33 направляет синтез мРНК только в клубнях картофеля.

Индуцибельные промоторы активируют регулируемые ими гены в ответ на какой-нибудь сигнал: химическое воздействие, освещение, изменение температуры, заражение вирусом и т.п.

Необходимыми элементами в составе генетических конструкций для экспрессии целевых генов в тканях трансгенных растений являются селективные и репортерные гены. Среди селективных генов наиболее широко при создании трансгенных растений применяется ген nptII, кодирующий синтез фермента неомицинфосфотрансферазы-II, что обеспечивает растительным клеткам устойчивость к антибиотикам канамицину и неомицину. Известен и ряд других селективных генов, среди которых можно назвать ген устойчивости к антибиотику гигромицину hpt, а также гены, обеспечивающие устойчивость к ряду различных гербицидов.

Репортерные гены используются для быстрого выявления временных и пространственных особенностей экспрессии данного конкретного гена. Репортерные гены позволяют определить визуально, в каких тканях растения происходит экспрессия перенесенного гена. Детекция белков репортерных генов основана, как правило, на цветной окраске, флюоресценции или люминесценции, которой могут обладать как сами белки, так и продукты их специфического ферментативного воздействия.