Способы переноса генетической информации

В настоящее время существует два основных способа переноса генетических конструкций в геном высших растений. Один из них основан на природной способности почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens переносить часть своей ДНК в растительный геном. Второй подход заключается в непосредственном переносе экзогенной ДНК в растительную клетку (при помощи генной пушки, методом электропорации протопластов, микроинъекций и т.д.).

Наиболее распространенным методом прямого переноса ДНК является бомбардировка растительных тканей микрочастицами металлов (биобаллистика). Этот метод впервые был использован для получения трансгенных растений в 1987 году. Метод заключается в обстреливании клеток растений микрочастицами (диаметр 0,5—1 мкм) вольфрама или золота с адсорбированными на их поверхности молекулами ДНК. Для этих целей необходимо использование специального оборудования — генной пушки. В качестве объекта для бомбардировки применяют, как правило, каллусы или тканевые экспланты (меристемы).

Электропорация протопластов. Основным условием для широкого применения методов прямой трансформации протопластов является наличие надежных, хорошо разработанных систем регенерации полноценных растений в культуре in vitro. При использовании этого метода фрагменты экзогенной ДНК поступают в протопласты (растительные клетки, лишенные целлюлозных оболочек) через поры в липидной оболочке, образованные действием короткого электрического импульса. Образование таких пор обратимо при условии, что сила приложенного электрического поля не превышает некоторого порогового значения. В противном случае, наступает массовая гибель клеток.

Использование полиэтиленгликоля (ПЭГ) для трансформации протопластов основано на его способности стимулировать в присутствии двухвалентных катионов преципитацию ДНК на поверхности мембраны с последующим поглощением фрагментов экзогенной ДНК посредством эндоцитоза.

Использование карбида кремния для трансформации клеток растений, каллусов и растительных эксплантов является очень простым и дешевым методом. Данный метод состоит в интенсивном совместном перемешивании (на шейкере) кристаллов карбида кальция с растительным материалом и фрагментами экзогенной ДНК, предназначенной для введения в клетки. При перемешивании кристаллы карбида кремния прокалывают целлюлозные оболочки, благодаря чему ДНК проникает в клетки и может интегрироваться в растительный геном. Основной недостаток данного метода состоит в низкой эффективности, обусловленной гибелью клеток при поранении.

Бактерии рода Agrobacterium – это почвенные бактерии, отдельные штаммы которых являются патогенными для растений и трансформируют их клетки. Круг растений-хозяев для патогенов рода Agrobacterium достаточно широк — более 600 видов двудольных, несколько видов однодольных и около 40 видов голосеменных растений. Почвенная бактерия A.tumefaciens способна вызывать в местах поранения у двудольных растений опухолевый рост зараженных клеток. Патогенные свойства почвенной бактерии A. tumefaciens связаны с наличием большой (около 200 т.п.н.) Ti (tumor inducing)–плазмиды. Геном A. tumefaciens представлен одной хромосомой и множеством (200—250) кольцевых фрагментов ДНК (плазмид), разного размера. Плазмиды большого размера (200—250т.п.н.) получили название мегаплазмид, среди которых Ti-плазмида выполняет роль ин-фицирующего фактора заболевания «корончатые галлы».

Основными составными частями Ti-плазмиды являются область Т-ДНК, гены катаболизма ферментов, vir-область и сайт инициации репликации в A.tumefaciens. Часть плазмиды, способная переноситься в растительную клетку и встраиваться в ядерный геном, получила специальное название - Т-ДНК (от английского transferred DNA). Остальная часть плазмиды, не принадлежащая к Т-ДНК, называется векторной ДНК.

Фрагмент Т-ДНК фланкирован прямыми повторами длиной 25 п.н. (правая и левая пограничные последовательности) и содержит гены двух типов: онкогены, кодирующие ферменты биосинтеза ростовых факторов растения (ауксинов и цитокининов), и ген синтеза опинов. Опухолевый рост инфицированных клеток, вызванный экспрессией ростовых факторов, создает экологическую нишу, а секретируемые опины служат источником углерода и азота для агробактерий. Помимо Т-ДНК Ti-плазмида содержит гены катаболизма опинов и гены вирулентности, необходимые для ее переноса в растительную клетку и стабильной интеграции в ядерный геном. В процессе агробактериального заражения фрагмент Ti-плазмиды (Т-ДНК) переносится в растительную клетку и интегрируется с ядерным геномом. Перенос осуществляется координированным действием генов (как правило, представленными шестью оперонами), расположенными в vir-области мегаплазмиды. На основе Ti-плазмиды A.tumefaciens была сконструирована серия так называемых «обезоруженных» (не содержащих онкогены) векторов, что положило начало прикладной генетической инженерии.