Методы изучения генетики бактерий

Выявление фенотипической изменчивости (модификации). При посеве Proteus mirabilis на питательный агар вырастают колонии протея, окруженные зоной «роения». При пересеве колоний петлей на поверхность питательного агара с 1% сухой желчью зоны роения исчезают, а при пересеве на обычный питательный агар все колонии вновь окружены зоной роения.

Определение Col-плазмид (колициногенных факторов). Исследуемые культуры E.coli засевают методом укола в питательный агар в чашку Петри (по 7-8 уколов на 1 чашку). Посевы инкубируют при 37⁰С сутки и на внутреннюю поверхность чашки помещают кусочек ваты, смоченный хлороформом, в парах которого бактерии погибают. Затем поверхность агара равномерно заливают 3 мл расплавленного и остуженного до 45⁰С полужидкого (0,7%) питательного агара, смешанного с 0,1 мл 4-часовой бульонной индикаторной культуры (наиболее чувствительной к данному типу колицина). Результат учитывают через 18-24 ч инкубации при 37⁰С: вокруг посевов культур, продуцирующих колицины, появляются зоны подавления роста индикаторного штамма.

Определение колицинотипа. В чашку Петри в питательный агар засевают эталонные штаммы бактерий с известным колицинотипом и инкубируют при 37⁰С сутки, после чего бактерии убивают в парах хлороформа. По поверхности агара равномерно распределяют 3 мл расплавленного и остуженного полужидкого агара, смешанного с 0,1 мл 4-часовой бульонной культуры E.coli неизвестного колицинотипа. Результаты учитывают через 18-24 ч. Если колицинотип индикаторной культуры и исследуемого штамма совпадут, то зоны подавления роста вокруг эталонного штамма не будет.

Тест перераспределения для выявления спонтанности мутаций. В две чашки Петри с питательным агаром вносят по 0,1 мл суточной культуры E.coli М17 и распределяют равномерно по поверхности питательной среды. Через 6 ч инкубации при 37⁰С в одной из чашек перераспределяют шпателем выросшие микроколонии. Через 24 ч из каждой чашки культуры пересевают методом отпечатков на поверхность питательного агара с рифампицином. Через 24 ч инкубации учитывают результат: на поверхности среды с рифампицином в чашке без перераспределения выросли единичные колонии рифампицинрезистентных мутантов, а в чашке с перераспределением выросли более многочисленные (в десятки – сотни раз) колонии антибиотикоустойчивых мутантов.

Данный опыт показывает, что антибиотикоустойчивые мутанты возникли спонтанно, до контакта бактерий с селективным агентом – рифампицином. Уже через 6 ч на среде без антибиотика появляются микроколонии антибиотикоустойчивых мутантов. Благодаря перераспределению бактерии мутанты из этих микроколоний распространяются по всей поверхности среды и после посева отпечатками на среду с антибиотиками дадут начало многочисленным колониям мутантов, в то время как отпечатки с чашки без перераспределения выявляют только небольшое число колоний, соответственно исходным микроколониям мутантов.

Индукция мутаций под действием ультрафиолетового (УФ) облучения. В качестве источника УФ-лучей используют бактерицидную лампу ВУФ-15, которую устанавливают на расстоянии 60 см от центра облучаемого объекта.

Для получения lac-мутантов E.coli предварительно выращивают на питательном бульоне в течение 14-18 ч. Клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 40 мл 0,1 моль раствора MgSО₄ и охлаждают на льду для прекращения деления клеток. Суспензию помещают в стерильную чашку Петри и облучают в течение 15-150 сек (предварительно определяют оптимальную мутагенную дозу, равную 0,1-1% от числа выживших бактерий), после чего клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в питательном бульоне. Пробирку с бульоном инкубируют при 37⁰С в течение 14-18 ч. Разведения 10^-2 – 10^-5 по 0,1 мл высевают на среду Эндо. Параллельно делают контрольные посевы. lac-мутанты E.coli на среде Эндо образуют бесцветные колонии.

Для выделения антибиотикорезистентных мутантов используют штамм E.coli В или К12, который высевают после облучения на минимальный агар с определенной концентрацией антибиотика. Параллельно делают контрольные посевы. Клетки E.coli, выросшие на этой среде является антибиотикорезистентными.

Постановка опыта конъюгации. Донор штамм E.coli К12 Hfr leu⁺Str^s. Реципиент – штамм E.coli К12 Fˉ leuˉ Str^r. Селективная среда – минимальная глюкозосолевая среда со стрептомицином.

К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульонной культуры донора и инкубируют 30 мин при 37⁰С. Затем смесь разводят до 10^-2 – 10^-3 и высевают по 0,1 мл на селективную среду в чашки Петри, где вырастут только рекомбинанты. В качестве контроля на среду сеют донорский и реципиентный штаммы, которые не будут расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрептомицину, а второй – ауксотроф по лейцину. После подстчета выросших колоний определяют частоту рекомбинаций по отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным.

Постановка опыта трансформации. Реципиент – штамм Bacillus subtilis Str^s (сенная палочка, чувствительная к стрептомицину). Донор – ДНК, выделенная из штамма B. subtilis Str^r (устойчивого к стрептомицину). Селективная среда для отбора рекомбинантов (трансформантов) – питательный агар, содержащий 100 ЕД/мл стрептомицина.

К 1 мл бульонной культуры B. subtilis добавляют 1 мл ДНК донора и инкубируют 30 мин при 37⁰С. Для определения количества образовавшихся стрептомицинустойчивых рекомбинантов 0,1 мл смеси высевают на селективную среду. Частоту трансформации определяют по отношению количества выросших колоний рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма.

Постановка опыта специфической трансдукции. Реципиент – штамм E.coli lac‾, лишенный β-галактозидазного оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг – фаг λ dgal, в геноме которого часть генов замещена β-галактозидазным опероном E.coli. Селективная среда – среда Эндо, на которой лактозоотрицательные колонии бактерий реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозоположительные колонии рекомбинантного штамма – ярко малиновые с металлическим оттенком.

К 1 мл 3-часовой бульонной культуре реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага в концентрации 10⁶ – 10⁷ частиц в 1 мл. Смесь инкубируют 60 мин при 37⁰С и готовят ряд десятикратных разведений. Из пробирки с 10^-6 разведением по 0,1 мл культуры высевают на три чашки со средой Эндо и инкубируют в течение суток. Величину трансдукции вычисляют по отношению количества клеток рекомбинантов, обнаруженных на всех чашках к числу клеток реципиентного штамма.