Электрофорез белков

При наличии заряда белки перемещаются в электрическом поле. Смеси белков можно разделять методом электрофореза – направленного движения белков от одного электрода к другому под действием постоянного электрического тока. Скорость движения зависит от массы белка и величины его заряда.

Метод электрофореза широко применяется в медицине, биохимии, биологии для изучения ферментов, тканевых и плазменных белков , при изготовлении лекарственных препаратов белковой природы.

8.4.2. Денатурация белка

Макроструктура белка является весьма чуткой к изменению условий среды, в которой существует белок.

В белковой молекуле существует постоянное равновесие между силами, формирующими третичную( четвертичную) и силами отталкивания. которые возникают внутри самой молекулы и при взаимодействии с окружающей средой. При нарушении этого равновесия изменяются четвертичная, третичная и даже вторичная структура( кроме первичной! ).

Возникает потеря природных свойств белка- денатурация.

Биуретовая реакция – обнаруживает пептидные связи. При добавлении иона Си(+2) в щелочной среде сопровождается развитием цветной фиолетовой окраски. Интенсивность окраски пропорциональна количеству пептидных связей( содержанию белка в биологической жидкости). В биохимической лабораторной диагностике на основе биуретовой реакции используют методики Фолина или Лоури.

Ксантопротеиновая реакция- при действии азотной кислоты и последующем нагревании смеси получается осадок желтого цвета. Обнаруживает ароматические аминокислоты в составе белка ( фенилаланин и тирозин)

Подробно методики приведены в «Практикуме по биоорганической химии»

авторы Каминская Л.А., Перевалов С.Г.

8. 6. Приложение. История развития химии белков

Термин белковый ( albumineise) был впервые применен французским химиком Ф. Кене в 1747 г. Так стали называть все биологические жидкости организма по аналогии с яичным белком. «Энциклопедия» Д. Дидро и Ж. Д^' Аламбера в 1751 году именно так объясняла этот термин. В дальнейшем начались систематические исследования белков.В 1759г. А.Кессель-Майер выделил клейковину из растений, в 1762г. А. Халлер изучал процесс образования и свертывания казеина молока, в 1777г. А. Тувенеель, работавший в С-Петербурге, назвал творог белковой частью молока. В тот же период французский химик А. Фуркруа доказал единую химическую природу белков растительного и животного происхождения.

В 1803 г. физик и химик Дж. Дальтон( ему принадлежит формулировка закона кратных отношений, исследование газовых законов и описание дефекта цветового зрения) отнес белки к азотсодержащим соединениям. В 1810г. известный всем школьникам Ж. Гей-Люссак провел химический анализ фибрина крови. Предполагают, что первым провел гидролиз белков А. Браконно в 1820 г. и получил аминокислоты, в том числе глицин и лейцин.

Первая теория строения белков принадлежит химику Г. Мульдеру, он сформулировал ее в 1836г.Он предположил, что существует минимальная структурная единица, из которой простроены все белки , состав ( 2 С₈ Н₁₂ N₂ + S0) и назвал ее протеином.

Позднее теория была опровергнута, но термин остался и прочно вошел не только в научный язык химиков.

В 1882г. В.Даль в «Толковом словаре русского языка» объясняет слово протеин- вещество, найденное в животных тканях.

В книге Д.И.Меделева( 2-е изд. СанктПетербург, Изд. Товарищества «Общественная польза» 1863г.), упоминаются термины белки и протеиновые вещества :

« Из органическихъ веществъ общи всемъ организмамъ протеновыи или белковыя вещества, отличающиеся сложным составомъ, способностью легко изменяться и даже способствовать измененiю других веществъ. Белковое вещество, производящее эти изменения, называется ферментомъ»( сохранено правописание).

Близок к открытию структуры белка был российский биохимик А.В. Данилевский

( 1838 – 1923), который много занимался изучением ферментов и проблемой питания.

В 1902 г. работы Т. Курциуса по синтезу пептидов привели к созданию пептидной гипотезы : « все белки состоят из аминокислот, соединенных между собой связью

–СО-NH»

Окончательно «пептидную теорию» сформулировали Э.Фишер и В. Гофмейстер( Нобелевская премия Э. Фишера 1902 г.)

ь Успешное изучение состава белков началось благодаря работам английского биохимика Ф.Сэнгера, который в 1945 разработал метод определения аминокислотной последовательности( лауреат Нобелевских премий 1958, 1980) и С. Мура, который сконструировал в 1958 г. автоматический аминокислотный анализатор.( Нобелевская премия 1972)

Строение пептидной группы стало возможным изучить после открытия метода рентгеноструктурного анализа.

Теорию строения а- спирали - и термин »вторичная структура» белка создал Л.Полинг ( 1951г. совместно с Р. Кори). Л. Полинг- лауреат Нобелевских премий ( по химии 1954, мира 1962).

Структура « складчатый» лист исторически была открыта раньше , У. Астбери в

1941 г. при рентгеноструктурных исследованиях белка кератина

Термин « четвертичная» структура был введен в 1958 г. английским кристаллографом Дж. Берналом в дополнение к принятым понятиям первичной, вторичной, и третичной структуры, а в 1965г. Ж. Моно ввел понятие «протомер» для названия наименьшей структурной единицы сложной белковой молекулы( чаще теперь называют «субъединица»)

Метод рентгеноструктурного анализа долгое время оставался самым точным для расшифровки пространственного строения белка: в 1936г Дороти Ходжкин исследовала и предложила пространственную структуру инсулина, в 1960 –Д.К.Кендрью – пространственное строение миоглобина. Сейчас используются компьютерное моделирование и приборные методы исследования: методы ЯМР

( ядерного магнитного резонанса) , ПМР протонного магнитного резонанса).

Для проверки усвоения темы рекомендуем ответить на вопросы:

1. Анализ дипептида показал, что он состоит из двух различных аминокислот : глицина и аланина. Сколько различных дипептидов можно составить?

2. Трипептид состоит из двух аминокислот: глицина и аланина. Запишите все возможные варианты строения этого трипептида.

3. Последовательность аминокислот в трипептиде: ала – глу - вал. Определите среду его водного раствора и заряд пептида в растворе.

4. Последовательность аминокислот в пептиде гли – лиз – сер. Этот пептид находится в растворе кислоты, рН= 3, 5. Определите величину заряда пептида.

5. Пептид состава асп – арг – фен находится в растворе в изоэлектрической точке.

Составьте формулу трипептида и определите область значения изоэлектрической точки ( кислая, нейтральная, щелочная). Какую надо создать среду, чтобы этот трипептид при электрофорезе двигался к катоду ?

6.Трипептид глутатион - антиоксидант крови и тканей – состоит из последовательно соединенных аминокислот : γ –глутамат- цистеин –аланин. Запишите формулу соединения и реакцию окисления этого соединения пероксидом водорода . .

ЛЕКЦИЯ 9