СРЕДСТВА СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ, ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ 3 глава

Для изучения подвижности культуру засевают уколом в полу­жидкий агар (0,2 %), посевы культивируют при 20...22 "С. Снача­ла возбудитель растет по уколу, затем рост распространяется по всему столбику питательной среды (подвижен). У выделенных культур бактерий изучают морфологические и тинкториальные свойства клеток, ферментативную активность.

Листерии разлагают с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, рамнозу, салицин, трегалозу, выделяют каталазу, обесц­вечивают при росте в МПБ ряд красителей (индикаторные среды с метиленовым синим, нейтральротом, метилротом, конгоротом, амидо черным в концентрации 0,001...0,003 %). Пробирки с инди­каторными средами засевают исследуемой культурой, помещают в термостат при 37 °С и учитывают результат через 3, 6, 24 и 48 ч. Помимо L. monocytogenes могут быть выделены другие виды листе­рий (L. denitrificans редуцирует нитраты, разлагает сахарозу и арабинозу; L. iwanonii постоянно ферментирует лактозу, не утилизи­рует рамнозу, образует двойную или тройную зону гемолиза на кровяном агаре. Оба вида листерий патогенны для мышей).

Для дифференциации листерий от возбудителя рожи свиней используют следующие критерии (табл. 19).

По 14 соматическим и 5 жгутиковым антигенам листерии под­разделяют на 16 основных серотипов (сероваров). По данным отечественных авторов, наиболее часто удается изолировать штаммы Первого серотипа.

Для видовой идентификации на предметное стекло наносят каплю поливалентной агглютинирующей сыворотки, в нее вносят суспензию 24-часовой агаровой культуры с концентра­цией клеток 1*10¹⁰/мл. Результат учитывают через 3 мин. По­ливалентная сыворотка агглютинирует все антигенные вариан­ты возбудителя, контролем служит суспензия бактерий в капле физиологического раствора. На втором этапе при помощи серотиповых сывороток определяют серотип выделенного возбу­дителя.

Биопроба. Метод применяют для обнаружения возбудителя в исследуемом материале и изучения патогенных свойств бакте­рий. В первом случае тканевой суспензией заражают двух-трех белых мышей подкожно или внутрибрюшинно по 0,3...0,5 мл. В положительном случае мыши погибают через 2...6 сут, особенно чувствительны 5...6-дневные мышата, которые гибнут через 18...36 ч. Павших животных подвергают бактериологическому ис­следованию.

Конъюнктивальную пробу ставят для дифференциации выде­ленной культуры от возбудителя рожи свиней. На конъюнктиву глаза морской свинки наносят две капли бульонной культуры изучаемой бактерии. Вирулентные листерии на 2...4 сут вызыва­ют гнойный кератоконъюнктивит.

Серологическая диагностика: серологические методы применяют в хозяйстве, где уже поставлен диагноз на листериоз, для выяснения эпизоотической ситуации. Использу­ют пробирочную РА и РСК. Диагностический титр РА для круп­ного рогатого скота и лошадей 1:400 (1:200 — сомнительный), для овец, коз и свиней — 1:200 (1:100 — сомнительный), для кроликов — 1:50 (1:25 — сомнительный). В РСК исследуют сы­воротки крови, разведенные 1:10.

Биопрепараты. Сухая живая вакцина против листериоза сельскохозяйственных животных из штамма АУФ представля­ет собой культуру лиофильно высушенного аттенуированного штамма листерии Первого серотипа. Вакцину контролируют на чистоту роста, безвредность и иммуногенность (на кроли­ках).

Листериозные диагностические агглютинирующие сыворотки. Листериозные флуоресцирующие сыворотки. Разработана вакцина из двух серотипов листерии.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Приготовить мазки из культур вакцинных штаммов листе­рии и возбудителя рожи свиней, окрасить по Граму, промикроскопировать, зарисовать.

2. Изучить культуральные и ферментативные свойства листе­рии и возбудителя рожи свиней.

3. Ознакомиться с биопрепаратами для специфической про­филактики и диагностики листериоза и рожи свиней.

Контрольные вопросы

1. Каковы морфологические, культуральные, ферментативные и патогенные
свойства возбудителей рожи свиней, листериоза?

2. В чем состоит лабораторная диагностика рожи свиней и листериоза?

3. Какова антигенная структура возбудителей рожи свиней, листериоза и какие
методы применяют для их серологической идентификации?

4. Какие методы используют для серологической диагностики листериоза?

5. Какие биопрепараты разработаны для специфической профилактики и диагностики листериоза и рожи свиней?

Тема 24

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА, ПАРАТУБЕРКУЛЕЗА, АКТИНОМИКОЗА. БИОПРЕПАРАТЫ

Цель занятия. Ознакомить студентов со свойствами возбудите­лей, методами лабораторной диагностики туберкулеза и парату-беркулеза, актиномикоза, биопрепаратами.

Оборудование и материалы. Суспензия микобактерий в смеси со стафилококками, эшерихиями (вакцина БЦЖ), культуры ми­кобактерий на среде Петраньяни (Левенштейна—Иенсена), кра­сители для окраски по методу Циля—Нильсена, биопрепараты.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Туберкулез. Это хроническое инфекционное заболевание до­машних и диких животных, в том числе птиц, а также человека. Характеризуется образованием туберкулов (бугорков) в различ­ных органах и тканях. Наиболее восприимчивы к туберкулезу крупный рогатый скот, свиньи и куры.

Возбудителя туберкулеза относят к роду Mycobacterium, семей­ству Mycobacteriaceae. Наибольшее значение в патологии сель­скохозяйственных животных (и человека) имеют следующие виды: М. tuberculosis — возбудитель туберкулеза человека, М. bovis — возбудитель туберкулеза крупного рогатого скота, М. avium — возбудитель туберкулеза птиц.

Лабораторная диагностика туберкулеза основана на результа­тах бактериологического и серологического исследований.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале (ме­тодом световой и люминесцентной микроскопии и биопробой), выделение чистой культуры и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным и патогенным признакам.

Материал для исследования. От павших или убитых с диагнос­тической целью сельскохозяйственных животных берут лимфа­тические узлы — заглоточные, подчелюстные, бронхиальные, средостенные, брыжеечные, печеночные, надвымянные, а также кусочки печени, легких и селезенки. Тушки птиц направляют в лабораторию целиком — исследуют пораженные печень, легкие, селезенку, яичники. От живых животных берут пробы молока и спермы. При взятии патологического материала необходимо со­блюдать правила личной безопасности.

Материал доставляют в лабораторию свежим, в замороженном виде или консервируют 30...40%-м водным раствором глицерина. Обсемененность патологического материала микобактериями ту­беркулеза может быть незначительной, поэтому для получения достоверных диагностических результатов специальными мето­дами обработки повышают концентрацию возбудителя. К обра­ботке предъявляют ряд требований: она должна обеспечивать го­могенизацию материала, уничтожать сопутствующую микрофло­ру, быть щадящей для микобактерий туберкулеза и способство­вать их концентрации в материале (обогащение).

Кусочки органов и тканей измельчают, заливают 3...10%-м ра­створом серной кислоты в соотношении 1 : 4, пробу центрифуги­руют при 3000 мин^-1 10... 15 мин. Осадок суспендируют в неболь­шом количестве физиологического раствора и используют для посевов и приготовления мазков для микроскопии (перед посе­вом осадок можно дополнительно отмыть физиологическим ра­створом два-три раза путем центрифугирования).

Пробу молока (150 мл) центрифугируют при 3000 мин^-1 20...30 мин. Осадок обрабатывают 3...6%-м раствором серной кислоты 20…30 мин, тщательно взбалтывают и центрифугируют. Осадок высевают на питательные среды.

Яйца перед исследованием инкубируют в термостате при 37...38 °С 20 дней, после чего содержимое измельчают, обрабаты­вают 3... 10%-м раствором серной кислоты, центрифугируют и осадок используют для посевов и микроскопии.

Для концентрирования микобактерий в исследуемом материа­ле применяют метод флотации. Материал гомогенизируют с фи­зиологическим раствором до консистенции сметаны и 10 мл гомогената вносят в колбу с узким горлом на 250 мл, добавляют 10 мл 1%-го раствора гидроксида натрия. Колбу закрывают и смесь встряхивают в течение 10 мин. Затем смесь разбавляют дис­тиллированной водой в соотношении 1:9 и прибавляют 1...2мл ксилола (петролейного эфира или авиационного бензина), смесь вновь встряхивают в течение 5... 10 мин, добавляют дистиллиро­ванную воду (до горлышка колбы) и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Микотуберкулезные бактерии концентри­руются во флотационном кольце у горлышка колбы вместе с кап­лями ксилола, которые, всплывая на поверхность, увлекают за со­бой и микобактерий. Содержимое образовавшегося кольца ис­пользуют для посевов и приготовления мазков для микроскопии, нанося материал на стекло несколько раз по мере подсыхания.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Микобакте­рий — прямые или слегка изогнутые палочковидные клетки раз­мером (0,2...0,6) х (1...10) мкм, без спор, капсул и жгутиков; грам-положительные, кислото- и спиртоустойчивые. Кислотоустойчивость связана с присутствием в клеточной стенке липидов и ми-коловой кислоты (до 60 %). В цитоплазме располагаются кислотолабильные гранулы, состоящие в основном из метафосфата (зерна Муха). Дилиды и воскоподобные вещества придают микробной клетке гидрофобность, т. е. способность отталкивать воду и водные растворы красителей, кислот, щелочей, в связи с чем бактерии туберкулеза (и паратуберкулеза) плохо восприни­мают окраску. Для окрашивания микобактерий применяют спе­циальные методы, среди которых самый распространенный — метод Циля—Нильсена. По Цилю—Нильсену микобактерий ок­рашиваются в ярко-красный цвет.

В препаратах М. tuberculosis обнаруживают в виде тонких пря­мых (изогнутых) палочек, М. bovis представляет собой короткие и толстые палочки, М. avium мельче остальных видов, со склоннос­тью к полиморфизму (рис. 78).

Бактериоскопический метод отличает невысокая чувстви­тельность: с его помощью возбудитель выявляют при концентра­ции микобатерий (1...5)10⁵/мл. Более результативна люми­несцентная микроскопия (ок­раска аурамин-родамином), благодаря которой выявляют даже незначительное количе­ство микобактерий, которые окрашены в бело-желтый цвет, а также формы с измененными тинкториальными свой­ствами.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Микобакте-
рии — аэробы, температурный оптимум 37...38 °С, рН 6,4...7. Растут медленно. Для культивирования микобактерий туберкулеза
используют сложные питательные среды, содержащие глицерин,
картофель, яйца, витамины. Рост бактерий стимулируют аспарагиновая кислота, альбумин, глюкоза, биотин, никотиновая кислота, соли аммония и др. Наиболее часто применяют среды Петраньяни, Левенштейна—Иенсена, Гельберга.

Рост микобактерий бычьего вида на плотных средах чаще обна­руживают на 20...60-е сутки, человеческого вида — на 14...40-е сут­ки, птичьего — на 10...20-е сутки (рис. 79).

М. bovis на плотных питательных средах формирует мелкие гладкие шаровидные колонии цвета слоновой кости, иногда с морщинистым сероватым налетом. На жидких средах образует пленку на поверхности сначала в виде единичных островков, по­зднее — сливающихся в сплошную пленку.

М. tuberculosis на плотных питательных средах дает рост в виде сухого морщинистого налета кремового цвета. У колоний при­поднятый центр, они крошковидные, с приятным запахом, по виду напоминают цветную капусту, плохо смачиваются водой. На жидких средах рост наблюдают на 5...7-е сутки в виде сухой морщинистой пленки, поднимающейся на края пробирок, среда остается прозрачной. На жидких средах и при внутриклеточном развитии образуется корд-фактор (трегалоза-6,6-дипиколат), способствующий сближению бактериальных клеток в микроко­лониях и их расположению в виде серпантинообразных кос, что можно наблюдать при микро­скопическом исследовании (рис. 80). В средах, содержа­щих детергент (твин-80), вследствие потери клетками гидрофобности наблюдают диффузный рост.

Рис. 80. Серпантинообразное распо­ложение клеток микобактерий в мик­рокультуре (корд-фактор)

М. avium на плотных яич­ных средах растет в виде глад­кого маслянистого налета. Колонии округлые, слизистые, мягкие, серовато-бе­лые, с возрастом желтеют, иногда образуют возвыше­ние в виде пуговицы с кратерообразным углублением. При первичной изоляции из патологического матери­ала колонии плоские и по­лупрозрачные. В жидких питательных средах возбу­дитель дает диффузный рост с формированием

влажной жирной пленки и образованием рыхлого осадка. Биохи­мические свойства микобактерий указаны в таблице 20.

Биопроба. Метод применяют не только для обнаружения воз­будителя в исследуемом материале, но и для определения его ви­довой принадлежности. Биопробу ставят параллельно с культу-ральными исследованиями.

Для определения вида заражают двух морских свинок, двух кроликов, при необходимости и двух кур. Перед постановкой биопробы морским свинкам и курам проводят туберкулинизацию. В опыт берут животных, не реагирующих на введение ту­беркулина. Для заражения используют культуру или исследуемый материал, обработанный серной кислотой (см. «Материал для исследования»). Морским свинкам суспензию материала вводят по 1...2 мл подкожно в паховую область, кроликам — внут­ривенно, курам — в подкрыльцовую вену. За подопытными жи­вотными ведут наблюдение, в течение трех месяцев. У морских свинок в положительных случаях через 2...3 нед в месте введения образуется уплотнение, потом язва, увеличиваются регионарные лимфоузлы. Через 30 сут после заражения свинкам повторяют ту-беркулинизацию. При наличии клинических признаков заболе­вания и положительной реакции на туберкулин одну морскую свинку подвергают убою с последующим патологоанатомическим исследованием и приготовлением из пораженных органов маз­ков, которые окрашивают по методу Циля—Нильсена. При обна­ружении в мазках микобактерий туберкулеза дают положитель­ное заключение на туберкулез и биологическое исследование прекращают.

Возбудитель относят к тому или иному виду микобактерий, основываясь на следующих результатах биопробы (табл. 21).

Серологическая диагностика: постановку РСК рекомендуют как дополнительный метод при отборе для диагно­стического убоя животных, положительно реагирующих на ту­беркулин.

Аллергическая диагностика. Не принадлежит к лабораторным методам, но на практике имеет ведущее значение для прижиз­ненного определения инфекции у животных, в том числе у птиц.

Применяют сухой очищенный туберкулин (протеин—пурифиед—дериват: ППД), который вводят крупному рогатому скоту, буйволам, верблюдам, оленям в толщу кожи в области средней трети шеи, свиньям — на наружную поверхность основания уха, курам — в толщу кожи бородки. Реакцию учитывают через 72 ч, измеряя толщину кожной складки с учетом припухлости. Поло­жительной реакцией считают тестоватый отек кожи размерами 35 х 45 мм и более, который на ощупь теплее окружающих тка­ней. Кожная складка увеличивается на 3 мм и более. Для измере­ния кожной складки используют кутиметр. У кур реакцию учи­тывают через 30...36 ч: при положительной реакции бородка опу­хает, становится горячей и отвисает.

Биопрепараты. Вакцина БЦЖ (BCG) представляет собой жи­вую лиофильно высушенную культуру вакцинного штамма ту­беркулезных микобактерий бычьего типа. Вакцинный штамм BCG (Bacillus Calmette — Gueriri) был получен в 1924 г. француз­скими учеными Кальметтом и Гереном путем длительного куль­тивирования (в течение 18 лет) вирулентного штамма М. bovis на картофельно-глицериновой среде с добавлением бычьей желчи. Для приготовления противотуберкулезной вакцины штамм БЦЖ выращивают на специальных средах в течение 20 дней. Приго­товленную вакцину высушивают методом лиофилизации и при­меняют для профилактики туберкулеза у людей (прививают всех новорожденных). В ветеринарной практике вакцину БЦЖ ис­пользуют в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах для про­филактики туберкулеза у крупного рогатого скота.

Сухой очищенный туберкулин ППД для млекопитающих го­товят из культуры микобактерий, которую выращивают в течение двух месяцев, а затем стерилизуют автоклавированием. Белок из культуральной жидкости осаждают трихлоруксусной кислотой. Преципитат белка, отделенный центрифугированием, растворя­ют в воде и вновь осаждают сульфатом аммония. Белок — это ос­новная фракция туберкулина ППД, содержание белка составляет 73,4...90 %. Кроме того, в состав препарата входят полисахариды, липиды, нуклеиновые кислоты.

Альттуберкулин (АТК) для млекопитающих — это стерильный фильтрат культуры микобактерий, выращенных в течение двух месяцев на мясо-гидролизатном картофельно-глицериновом бу­льоне. Бульон концентрируют, выпаривая до 1/10 первоначаль­ного объема, и затем добавляют 20 % экстракта бактериальной массы микобактерий.

ППД-туберкулин для птиц готовят, используя пять штаммов М. avium. Выделение белка из культуральной жидкости и приго­товление препарата проводят, как при получении АТК.

Сухой очищенный комплексный аллерген из атипичных ми­кобактерий (КАМ) готовят во ВГНКИ по типу ППД-туберкули-на. Симультанную пробу КАМ используют в качестве дополни­тельного метода диагностики в благополучных по туберкулезу хо­зяйствах. Туберкулины контролируют на стерильность, безвред­ность, специфичность и активность.

Паратуберкулез (паратуберкулезный энтерит). Хроническая бо­лезнь крупного рогатого скота, реже овец. Характеризуется нару­шением деятельности желудочно-кишечного тракта, приводя­щим к истощению и гибели животного

Возбудитель паратуберкулеза — М. paratuberculosis, род Mycobacterium, семейство Mycobacteriaceae.

Лабораторная диагностика паратуберкулеза основана на ре­зультатах бактериологического и серологического исследований.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой и люминесцентной микроскопии (микроско­пия — это основной метод), выделение чистой культуры посевом на питательные среды и идентификацию возбудителя по культу-рально-морфологическим признакам.

Материал для исследования. От павших или убитых с диагнос­тической целью животных берут пораженные участки подвздош­ной кишки — утолщенные, с выраженной складчатостью слизис­той оболочки и брыжеечные лимфоузлы. От живых животных в лабораторию направляют фекалии с примесью слизи и крови и соскобы со слизистой оболочки прямой кишки.

Микроскопия препаратов из исходного материала. В мазках, ок­рашенных по методу Циля—Нильсена, возбудители паратуберку-леза темно-красного цвета, палочковидной формы, размером (0,6...2) х (0,2...0,5) мкм. Для старых культур характерен полимор­физм: палочки могут быть расширенными или в виде глыбок, кокков. В мазках из патологического материала клетки распола­гаются кучками в виде «палисада» (частокола). Возбудитель не­подвижен, не образует спор и капсул, кислотоустойчив.

Кроме световой применяют также люминесцентную микро­скопию мазков-отпечатков из патологического материала, окра­шенных флуорохромами, как при туберкулезе.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Культиви­рование и выделение чистой культуры возбудителя сопряжены с большими трудностями. В питательные среды добавляют (до 1...4%) ростовой фактор микобактин — спиртовой экстракт из микобактерий флей (тимофеевой травы) или же экстракт из ми­кобактерий других видов. По типу дыхания возбудитель — аэроб, температурный оптимум 38 °С.

В жидких питательных средах образует нежную беловатую пленку, которая через З...4мес опускается на дно пробирки. На плотных питательных средах через 1,5...2мес вырастают сухие сморщенные беловато-серые или желтоватые колонии.

Биопроба. При паратуберкулезе этот метод не применяют, так как лабораторные животные к возбудителю невосприимчивы.

Серологическая диагностика основана на ис­следовании в РСК: реакцию ставят с пробами сывороток крови от больных животных по общепринятой методике.

Аллергическая диагностика. Метод, применяемый в хозяйствах. Для аллергической диагностики паратуберкулеза у крупного ро­гатого скота используют альттуберкулин для птиц, стандартный сухой очищенный туберкулин ППД для птиц и паратуберкулин, у овец — сухой очищенный туберкулин ППД для птиц.

Актиномикоз. Хроническая бактериальная инфекция; характе­ризуется образованием в различных тканях плотных, четко огра­ниченных припухлостей — актиномиком, подверженных некро­тическому распаду (рис. 81). Восприимчивы различные виды жи­вотных и человек. Возбудитель — бактерия из группы актиномицет — Actinomyces bovis. У человека актиномикоз вызывает A. Israeli.

Лабораторная диагностика актиномикоза основана на резуль­татах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале ме­тодом световой микроскопии, выделение чистой культуры посе­вом на питательные среды и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим и ферментативным свойствам.

Материал для исследования. В лабораторию направляют пора­женные лимфатические узлы, стерильно взятый гной из абсцес­сов.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Для приго­товления препаратов в материале находят твердые серовато-бе­лые зернышки с зеленоватым оттенком — друзы, которые пред­ставляют собой скопление клеток возбудителя. Их промывают в дистиллированной воде и переносят на предметное стекло в кап­лю 10...20%-го раствора гидроксида натрия или калия, выдержи­вают 15 мин или слегка подогревают над пламенем горелки. Ок­рашивают по Граму. Затем наносят каплю 50%-го водного ра­створа глицерина, накрывают препарат покровным стеклом и ис­следуют под малым увеличением микроскопа или с помощью иммерсионной системы. При микроскопировании заметен гомо­генный центр друзы, состоящий из густо переплетенных ните­видных палочек, булавовидно утолщающихся к периферии (рис. 82). Центр друзы окрашен грамположительно, а перифери­ческая часть — грамотрицательно. Такая микроскопическая кар­тина характерна и имеет диаг­ностическое значение. Друзы в экссудате могут быть не всегда, несмотря на наличие отдельных клеток.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Возбуди­тель — факультативный анаэроб, температурный оптимум 37...38 ºС. Материал высевают на МПА, содержащий 1 % глюкозы, ПЖА с 1 % глюкозы, кро­вяной или сывороточный агар.

Макроскопически видимые колонии появляются через 7…14 дней, иногда 15...30 дней культивирования. Колонии на МПА с глюкозой первоначально белые, мягкой консистенции, с ровными краями, иногда с кли­новидными выступами по периферии. Со временем колонии приобретают светло-коричневую окраску. При выращивании в анаэробных условиях формируются гладкие, выпуклые, непроз­рачные, влажные колонии, на кровяном МПА вокруг колоний образуется слабая зона гемолиза. В мазках из культур, выращен­ных в аэробных условиях, обнаруживают нити и цепочки из грамположительных палочек, в анаэробных — короткие палочки.

У выделенных культур изучают ферментативную активность: возбудитель разжижает желатину, ферментирует с образованием кислоты глюкозу, левулезу, галактозу, глицерин.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Приготовить мазки из смеси бактерий, окрасить по методу Циля—Нильсена, промикроскопировать, зарисовать.

2. Описать характер роста микобактерий на питательных сре­дах.

4. Ознакомиться с биопрепаратами.

Контрольные вопросы

1.Какова таксономическая характеристика возбудителей туберкулеза и парату­беркулеза?

2.Каковы морфологические и тинкториальные особенности возбудителей ту­беркулеза и паратуберкулеза?

3.В чем состоят культуральные особенности возбудителей туберкулеза и пара­туберкулеза?

4.По каким свойствам дифференцируют возбудителей туберкулеза и парату­беркулеза?

5.В чем заключается лабораторная диагностика актиномикоза?

Тема 25

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ. БИОПРЕПАРАТЫ

Цель занятия. Ознакомить студентов со свойствами возбудите­ля, схемой лабораторной диагностики сибирской язвы, биопре­паратами.

Оборудование и материалы. Культура вакцинного штамма В. anthracis на МПА, в МПБ, мазки с феноменом «ожерелья», си­биреязвенная преципитирующая сыворотка, стандартный анти­ген, пробирки Уленгута, штативы, пипетки Пастера, сибиреяз­венные биопрепараты.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Сибирская язва. Острое инфекционное заболевание сельско­хозяйственных животных многих видов, а также человека; харак­теризуется признаками септицемии или образованием карбунку­лов, у свиней часто протекает с поражением заглоточных лимфа­тических узлов.

Возбудитель сибирской язвы — бактерия Bacillus anthracis, род Bacillus.

Лабораторная диагностика сибирской язвы основана на резуль­татах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале (ме­тодом световой и люминесцентной микроскопии, а также био­пробой), выделение чистой культуры и идентификацию возбуди­теля по культурально-морфологическим признакам. При нечет­ких результатах применяют и другие методы.

Материал для исследования. В лабораторию направляют ухо от трупа животного, перевязанное у основания (ухо отрезают с той стороны, на которой лежит труп), или кровь из надреза уха в виде толстого мазка на двух предметных стеклах (чтобы исклю­чить попадание возбудителя во внешнюю среду, место разреза прижигают шпателем); от трупов свиней -заглоточные лимфа­тические узлы и участки отечной соединительной ткани. Если подозрение на сибирскую язву возникло в ходе вскрытия, его прекращают и на исследование направляют часть селезенки.

Нативный материал помещают в чистую посуду (пробирки, банки). Высушенные мазки кладут в чашки Петри, которые обо­рачивают плотной бумагой. На упаковке делают надпись «Мазок не фиксирован!» Посуду с материалом помещают во влагонепро­ницаемую тару, обвязывают, пломбируют или опечатывают, де­лают надпись «Верх. Осторожно!» и с сопроводительными доку­ментами нарочным направляют в лабораторию.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Возбудитель представляет собой грамположительные прямые палочковидные бактерии размером (l...l,5) х (6...10) мкм, без жгутиков, образует спору и капсулу.

Из поступившего в лабораторию материала готовят мазки, ок­рашивают по Граму; одним из методов для выявления капсулы (методы Михина, Гимзы, Ольта и т. д.), а также сибиреязвенными люминесцирующими сыворотками. В окрашенных мазках из трупного материала возбудитель обнаруживают в виде крупных грамположительных палочковидных бактерий, располагающихся одиночно, парами, короткими цепочками. Концы палочек, обра­щенные друг к другу, резко обрублены,.свободные концы закруг­лены, клетки окружены капсулой. В отдельных случаях, особен­но в мазках из материала, полученного от свиней, форма клеток может быть нетипичной: короткие, толстые, изогнутые или зер­нистые палочки со вздутием в центре или на концевых частях бактерий.

Предварительный ответ в хозяйство, откуда поступил матери­ал, ддют немедленно по результатам микроскопического иссле­дования.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Факульта­тивный анаэроб, температурный оптимум 35...37 °С, рН 7,2...7,4. С целью выделения культуры возбудителя исследуемый материал засевают в МПБ, на МПА или в бульон и агар Хоттингера и ин­кубируют в аэробных условиях 18...24 ч, а при отсутствии роста — до 48 ч.

На МПА М. anthracis формирует плоские, матово-серые, ше­роховатые, с отростками на краях колонии (R-форма), может образовывать и атипичные коло­нии без отростков. Края коло­ний R-формы под малым увели­чением микроскопа имеют вид локонов, получивших название «львиная грива» (рис. 83). В МПБ рост возбудителя характе­ризуется образованием на дне пробирки рыхлого осадка при прозрачной питательной среде; после встряхивания осадок раз­бивается на хлопья. Если возбудитель выращивать на питательных средах, содержащих сыво­ротку крови, и в атмосфере с повышенным содержанием оксида углерода (IV), то на МПА образуются гладкие колонии S-формы, а в МПБ отмечают рост в виде диффузного помутнения среды.

Рис. 83. Колонии В. anthracis на агаре под малым увеличением. Образование локонов