К. Танака Дж. Б.Фенн

Коичи Танака (Koichi Tanaka) родился в 1959 г. в г.Тояма (Япония), окончил университет в Тохоку, работает инженером в корпорации «Шимадзу» в Киото.

Джон Б.Фенн (John B.Fenn) родился в 1917 г. в Нью-Йорке (США). В 1940 г. получил докторскую степень по химии, в 1987 г. - звание заслуженного профессора Яальского Университета (штат Коннектикут). С 1994 г. преподает в Государственном университете Виргинии (г. Ричмонд, штат Виргиния).

В 50-х годах исследователи показали, что заряженные продукты (ионы), полученные разрушением исходной молекулы в вакууме пучком электронов, можно анализировать методом масс-спектрометрии и по результатам установить строение органического соединения. Тогда основным источником ионизации был электронный удар, а в ионную форму вещество переводили из газообразного состояния, нагрев пробу до 350-400°С. Поэтому анализ неустойчивых при нагревании и трудно летучих соединений представлял определенные трудности. Позже анализируемые образцы химическим синтезом превращали в более стабильные соединения с повышенной летучестью, для ионизации использовали электронный пучок с энергией 70 эВ. Такие усовершенствования обеспечили хорошо воспроизводимые многолинейчатые масс-спектры, однако определить по ним строение неизвестных веществ было невозможно. Это походило на сборку глиняного горшка, разбитого на тысячи мелких осколков.

Дальнейшие исследования были направлены на поиск условий и создание масс-спектрометров, которые позволили бы изучать неустойчивые соединения без предварительной модификации, разрушать их на небольшое количество фрагментов и получать их молекулярные ионы и масс-спектры. Существенной модификации подвергался лишь источник ионов, где анализируемое вещество превращается в заряженные частицы, но опробовались и более мягкие методы: фотоионизация, полевая десорбция, химическая ионизация, бомбардировка быстрыми атомами, плазменная десорбция, лазерная десорбция/ионизация, ионизация при атмосферном давлении. Все эти методы применяются в современной масс-спектрометрии, с их помощью можно только получать (но не фрагментировать) молекулярные ионы для синтетических и природных органических соединений большинства классов.

Применение мягких методов ионизации анализируемых веществ привело к тому, что масс-спектрометрия потеряла свое значение как структурно-аналитический метод, она превратилась в детектор молекулярных масс. Частично эта потеря была восстановлена, когда появился метод тандемной масс-спектрометрии, позволяющий фрагментировать молекулярный ион соударением его с молекулами инертного газа в специальной камере, которая устанавливается на пути движения иона к анализатору.

Использовать энергию лазера для испарения образца и его ионизации пытались несколько групп исследователей начиная с 80-х годов. Фокусируя узкий луч лазера на небольшой поверхности жидкого или твердого образца, удавалось перевести какое-то его количество в газообразное состояние без деградации. Русский исследователь В.С.Летоков впервые показал, что такой прием пригоден для ионизации небольших полярных молекул, таких как аминокислоты. В 1985 г. немецкие ученые М.Карас и Ф.Хилленкамп в Мюнстере (ФРГ) обнаружили, что используя некоторые абсорбирующие материалы, можно повысить летучесть полярных веществ небольшой молекулярной массы, однако эти условия не подходили для ионизации крупных молекул.

Через два года эту проблему разрешил К.Танака. Он показал, что для перевода таких высокомолекулярных белков, как химотрипсиноген (25717 Да), карбоксипептидаза А (34472 Да) и цитохром С (12384 Да), в газообразное состояние и формирования ионов необходимо облучать образец лазером с низкой энергией. Танака использовал лазер с длиной волны 330 нм, которая не поглощалась ароматическими аминокислотами белков и пептидов, благодаря чему достигалась минимальная фрагментация макромолекул. Танака растворял анализируемые образцы в глицерине, содержащем коллоидные частицы, именно эта вспомогательная добавка обеспечила основной успех экспериментов. В англоязычной литературе подобную добавку называют матрицей. И хотя матрица Танаки не нашла широкого применения, идею подхватили многие исследовательские группы, в результате был создан метод матрично-активированной лазерной десорбции и ионизации. Основное требование к матрицам - они должны иметь максимумы поглощения близкие к длине волны используемого лазера. В современных масс-спектрометрах чаще применяется азотный лазер с длиной волны 337 нм. Матрицами для белковой химии служат оксо- и гидроксипроизводные бензойной, коричной и никотиновой кислот.

Комбинация лазерного источника ионизации с времяпролетным масс-анализатором привела к созданию масс-спектрометров, позволяющих определять молекулярные массы до 500 кДа. Большой вклад в повышение разрешающей способности времяпролетных масс-анализаторов внесли русские ученые Б.А.Мамырин, предложивший использовать режим отражения, и А.Ф.Додонов, впервые применивший ортогональный ввод ионов образца. Идеи этих ученых широко используются зарубежными фирмами при изготовлении современных масс-спектрометров для рынка.

В основе работ другого нобелевского лауреата - Дж.Фенна - лежит теория образования заряженных ионов при распылении образца в электрическом поле, разработанная М.Доле в 1968 г. по результатам экспериментов, проведенных Дж.Зелени в 1917 г. Принципиальное отличие такого метода ионизации в том, что в масс-спектрометр вводится не образец для его последующего перевода в газообразное состояние и ионизации, а готовый ион, образующийся в специальной приставке. Она представляет собой пульверизатор, на выходную иглу которого подается напряжение в несколько тысяч вольт, и в зависимости от параметров эксперимента и типа прибора формируются либо кластеры анализируемого соединения с молекулами растворителя, либо «голый» ион вещества, а в случае белков - целый ряд многозарядных ионов.

В лаборатории Фенна в Яале в 1984 г. электропульверизатор был впервые соединен с масс-спектрометром, и четыре года спустя американский химик доложил, что по масс-спектрам многозарядных ионов пептидов и белков можно определять их молекулярные массы с точностью 0.01%. Исследования в Яале были начаты сразу после публикации в 1984 г. работы русских ученых - М.Л.Александрова, Л.Н.Галля, В.Н.Краснова и др. - по ионизации веществ при атмосферном давлении.

Последующее развитие метода ионизации распылением в электрическом поле направлено на повышение его чувствительности, сокращение объемов анализируемых растворов за счет уменьшения скорости распыляемого потока с десятков микролитров в минуту до нанолитров. По сравнению с методом матрично-активированной лазерной десорбции и ионизации, разработанным Танакой, метод Фенна более трудоемок и менее

производителен, но в сочетании с тандемной масс-спектрометрией дает максимум информации об анализируемом белке, особенно если его строение не известно.

Нобелевская премия - достойная оценка заслуг Танаки и Фенна, давших возможность одному из самых информативных методов инструментального анализа - масс-спектрометрии - изучать жизненные процессы или, как это теперь называют, протеомику.