ATP-зависимые протеазы прокариот

Внутриклеточный протеолиз – это строго контролируемый процесс, который, как выяснилось в последнее время, у про- и эукариот осуществляется высокомолекулярными мультимерными энергозависимыми протеиназами. Эти протеиназы выполняют две основные функции: освобождают клетки от дефектных, поврежденных и мутантных белков – деструктивная функция, и осуществляют деградацию ряда короткоживущих регуляторных белков – регуляторная функция.

Энергозависимые протеиназы – особая группа протеиназ, обладающая целым рядом уникальных характеристик. Протеолитическая активность этих ферментов сопряжена с гидролизом АТР. Ферменты проявляют высокую селективность, поскольку производят отбор субстратов-мишеней из общего пула внутриклеточных белков, большая часть которых не должна повреждаться. При этом специфичность по отношению к аминокислотам, образующим расщепляемую связь, у энергозависимых протеиназ зачастую не выражена. Деградация белков-субстратов происходит по процессивному механизму – без высвобождения высокомолекулярных промежуточных продуктов. Все известные энергозависимые протеиназы являются олигомерами.

Основные проблемы при изучении АТР-зависимых протеиназ определяются особенностями этих ферментов и состоят в установлении принципов отбора белкового субстрата и механизма сопряжения гидролиза АТР и протеолиза. В клетках Escherichia coli к настоящему времени обнаружено пять АТP-зависимых протеиназ – Lon (La), FtsH (HflB), ClpAP (Ti), ClpXP и HslVU (ClpQY).

Lon и FtsH относятся к семейству ААА-белков (АТРаз, ассоциированных с другими клеточными активностями). Протеолитический и АТPазный центры этих ферментов локализованы в одной полипептидной цепи, и они функционируют как гомоолигомеры. Схематически структуры этих протеиназ сопоставлены на рис. 4.4.2.

Рис. 4.4.2. Схема строения Lon- и FtsH-протеиназ

Исторически Lon-протеиназа явилась первой обнаруженной АТР-зависимой протеиназой. Косвенные сведения о существовании фермента, селективно гидролизующего дефектные белки в клетках E. coli, появились еще в 70-х годах, однако выделен он был в начале 80-х, а аминокислотная последовательность Lon-протеиназы (784 аминокислотных остатков (а.о.)) была расшифрована только в 1988 году одновременно в лаборатории проф. А.Гольдберга (США) и в лаборатории химии протеолитических ферментов ИБХ.

Сначала ферменту приписывали исключительно деструктивную функцию. И только в последнее время стало ясно, что кроме деградации дефектных белков, то есть выполнения роли “санитара клетки”, Lon-протеиназа расщепляет еще и целый ряд короткоживущих регуляторных белков. Считается, что Lon-протеиназа E. coli функционирует как тетра- или октамер.

Субъединица Lon-протеиназы состоит из трех функциональных доменов (рис. 4.4.2). Протеолитическим является С-концевой домен (Р-домен, His567-Lys784), содержащий каталитически активный остаток Ser679 в составе строго консервативного для Lon-протеиназ из различных источников октапептида PKDGPSAG. Надо отметить, что аминокислотная последовательность протеолитического домена не обнаруживает гомологии ни с одной из известных групп сериновых протеиназ, активный центр которых представлен так называемой классической каталитической триадой – Ser, His, Asp. Более того, показано, что наличие в Lon-протеиназе классической триады маловероятно, однако, есть основания полагать, что в активном центре фермента функционирует каталитическая диада Ser – Lys (такой тип активного центра обнаружен в последнее время у ряда сигнальных протеиназ). Протеолитическая функция Lon-протеиназы реализуется исключительно полноразмерным ферментом и только в условиях функционирования АТРазного центра; изолированный протеолитический домен проявляет лишь пептидгидролазную активность. Lon-протеиназа способна гидролизовать пептидные субстраты в отсутствие АТР; в присутствии комплекса АТР-Mg скорость гидролиза пептидов значительно возрастает; ADP-Mg ингибирует пептидгидролазную активность фермента. Нарушение олигомерной структуры Lon-протеиназы приводит к утрате протеолитической активности, однако пептидгидролазная активность сохраняется.

Lon-протеиназа гидролизует АТР и в отсутствие белкового субстрата, проявляя так называемую “базовую” АТРазную активность. Связывание белкового субстрата приводит к повышению АТРазной активности. АТРазный центр локализован в центральном домене (А-домен, Glu108-Lys566, рис. 4.4.2), который состоит из двух субдоменов (а.о. 108-339 и 340-566). Первый субдомен состоит из протяженных a-спиральных участков и, возможно, вовлечен в обеспечение регуляторных функций фермента. Второй субдомен осуществляет АТРазную функцию и содержит мотивы Уолкера: А и В – консервативные фрагменты последовательности, характерные для ряда АТР-связывающих белков и АТРаз. Мотивы Уолкера участвуют в связывании нуклеотида и иона магния и присутствуют во всех АТР-зависимых протеиназах E. coli. В АТРазном домене локализован также дополнительный центр связывания белкового субстрата, который, как предполагается, участвует в распознавании белка-мишени.

Прямая корреляция эффективности функционирования протеолитического и АТРазного центров Lon-протеиназы отсутствует. При физиологических концентрациях АТР и ионов Mg (3 и 15 мМ, соответственно) свободные ионы металла проявляют регуляторные свойства, активируя протеолитическую и пептидгидролазную функции фермента и ингибируя базовую АТРазную функцию. Показано, что комплекс ADP-Mg – ингибитор АТРазной и протеолитической активности нативной Lon-протеиназы – активирует пептидгидролазный центр мутантной формы фермента с заменой K362Q, функционирующей в форме мономера. Это позволило сформулировать предположение о существовании двух путей передачи сигнала от АТРазных центров к протеолитическим – внутрисубъединичного и межсубъединичного: 1) внутри субъединиц пептидгидролазные центры активируются при связывании нуклеотида любого типа в присутствии ионов магния; 2) при межсубъединичной передаче сигнала пептидгидролазные центры активируются при связывании в “сопряженных” субъединицах комплекса ATP-Mg и ингибируются при связывании ADP-Mg (действие последнего носит доминирующий характер).

Функция N-концевого домена (N-домен, Met1-Gly107, рис. 4.4.2) еще не определена. Однако следует отметить, что у большого количества Lon-протеиназ, выявленных в настоящее время в различных эволюционно отдаленных источниках (в том числе и в клетках эукариот), именно N-концевые домены являются наиболее вариабельными по размеру (от 96 до 287 а.о.) и по первичной структуре. Степень подобия в протеолитических (от 206 до 239 а.о.) и в АТР-азных (от 458 до 538 а.о.) доменах весьма высока.

Отличительной особенностью Lon-протеиназы является ее способность к связыванию ДНК, однако до сих пор ДНК-связывающий участок не локализован.

FtsH-протеиназа – единственная мембрано-связанная АТР-зависимая протеиназа E.coli, относится к семейству Zn-зависимых металлопротеиназ. Первичная структура фермента (644 а.о.) опубликована в 1993 г. В N-концевой части фермента локализованы два богатых гидрофобными аминокислотами участка, образующих a-спиральные трансмембранные сегменты ТМ1 и ТМ2 (рис. 4.4.2), с помощью которых FtsH-протеиназа дважды пересекает цитоплазматическую мембрану, при этом фрагмент последовательности между сегментами ТМ1 и ТМ2 локализуется в периплазматическом пространстве. Основная часть молекулы (а.о. 121-644) – цитоплазматическая. Центральный ее фрагмент (около 200 а.о.) проявляет высокую гомологию с рядом АТРаз и содержит две пары мотивов Уолкера (А1-В1 и А2-В2, рис. 4.4.2). В С-концевом фрагменте FtsH-протеиназы обнаружена характерная для металлопротеиназ Zn-связывающая последовательность с двумя остатками гистидина (H414EAGH418). Предполагается, что фермент функционирует как димер или тетрамер и расщепляет, в основном, регуляторные белки (таблица). Получены данные в пользу участия молекулярных шаперонов (в частности, DnaK, DnaJ, GrpE) в презентации белков-мишеней для деградации ферментом. Показано, что FtsH-протеиназа является единственной АТР-зависимой протеиназой, наличие которой необходимо для жизнеспособности клеток E. coli. Возможно, это связано с собственной шапероноподобной активностью фермента.

Семейство Clp-протеиназ (т.е казеинолитических, или шапероноподобных протеиназ) в клетках E. coli представлено тремя ферментами. Все они – гетероолигомеры, состоящие из протеолитических (ClpP и HslV) и АТРазных (ClpA или ClpX и HslU) субъединиц.

ClpP-субъединица – общая для ClpAP- и ClpXP-протеиназ. В аминокислотной последовательности ClpP (193 а.о.) обнаружены каталитически активные остатки Ser97, His122 и Asp171. Изолированная ClpP-субъединица не способна гидролизовать белковые субстраты, но обладает пептидгидролазной активностью. АТРазные субъединицы ClpA и ClpX относят к двум различным классам Clp-белков: ClpA (784 а.о.) [57] принадлежит к белкам первого класса, которые содержат два нуклеотид-триггерных центра, разделенных вариабельной спейсерной областью, ClpX (424 а.о.) – белок второго класса, представители которого существенно меньше по размеру и содержат один АТРазный центр. Таким образом, протеолитические комплексы ClpAP и ClpXP представляют собой АТР-зависимые сериновые протеиназы с классической каталитической триадой.

HslUV принадлежит к недавно открытому подсемейству протеиназ, каталитически активным остатком которых является N-концевой остаток треонина. АТРазный компонент HslUV-протеиназы (HslU) относится к Clp-белкам второго класса, содержит мотивы Уолкера и обладает высокой гомологией с ClpX-субъединицей. Протеолитическая HslV-субъединица состоит из 176 а.о., несет каталитически активный остаток Thr1 и проявляет пептидгидролазную активность.

На первых этапах (стадии 1 и 2) функционирования протеиназ Clp-семейства происходит сборка активного мультисубъединичного комплекса фермента. По данным электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа ClpР образует структуру из двух гептамерных колец, наложенных друг на друга. У HslV кольца состоят из 6 субъединиц. АТРазные субъединицы представляют смесь нестабильных мономеров и димеров, которые в присутствии АТР образуют стабильные структуры из гексамерных колец (для HslU возможен также вариант с гептамерными кольцами). Вслед за этим в присутствии АТР окончательно формируется полный фермент, состоящий из колец протеолитических субъединиц, фланкированных кольцами АТРазных субъединиц (стадия 2).

Распознавание и связывание белка-субстрата осуществляется регуляторным АТРазным компонентом – либо его свободной формой, либо в составе полноразмерного фермента (стадия 3). То, что именно АТРазный компонент определяет селективность действия фермента подтверждается тем фактом, что ClpAP и ClpXP, имеющие общий протеолитический компонент, гидролизуют разные внутриклеточные субстраты. Следующим шагом в функционировании фермента считается разворачивание молекулы субстрата и транслокация ее в область протеолитических центров (стадия 4). Надо отметить, что на этом этапе АТРазные субъединицы могут проявлять шапероноподобную активность и участвовать в рефолдинге белков. Далее происходит процессивное расщепление субстрата внутри мультисубъединичного ферментного комплекса и высвобождение продуктов (стадия 5).

Таким образом, пять рассмотренных выше АТР-зависимых протеиназ E. coli представляют четыре различных подсемейства протеолитических ферментов и, следовательно, не проявляют структурной гомологии в своих протеолитических компонентах. АТРазные субъединицы и домены этих протеиназ также не проявляют выраженной гомологии.