Сайт-специфическое изменение свойств ферментов генно-инженерными методами

Сайт-специфический мутагенез можно использовать как для придания новых свойств уже существующим белкам, так и для создания уникальных ферментов. Выбор аминокислоты, подлежащей замене, как правило, производится с учетом ее роли в функционировании белка. Данные об этом получают в ходе ренгеноструктурного анализа трехмерной структуры белка.

Повышение термостабильности путем образования дополнительных дисульфидных связей

Образование в белковой молекуле дополнительных дисульфидных связей может способствовать значительному повышению термостабильности белковой молекулы. Необходимо, чтобы новые связи не мешали нормальному функционированию белка. В одном из экспериментов при помощи олигонуклеотид-направленного мутагенеза были созданы шесть вариантов лизоцима фага Т4 с новыми внутрицепочечными дисульфидными связями. Для этого два, четыре или шесть специфических аминокислотных остатков полипептидной цепи были заменены на остатки цистеина, в результате чего образовалась одна, две и три дисульфидных связи соответственно. Были использовано несколько вариантов положений аминокислотных остатков. Аминокислотные остатки, замененные на остатки цистеина, располагались близко друг к другу, так что при образовании новых дисульфидных связей общая конформация молекулы существенно не изменялась. Кроме того, они находились вне активного центра фермента.

После мутагенеза мутантные гены клонировали в клетках E.coli, рекомбинантные белки очищали и определяли их ферментативную активность и термостабильность. Последняя обычно характеризуется температурой, при которой молекула денатурирует на 50% (степень денатурации определяется по изменению кругового дихроизма в растворе белка). Исходная (нативная) форма лизоцима Т4 содержит два свободных остатка цистеина, не участвующих в образовании дисульфидных связей. У фермента «псевдодикого типа» они заменены на остатки Thr и Ala, при этом активность и термолабильность остались прежними.

Результаты этого эксперимента показали, что термостабильность фермента повышается при образовании новых дисульфидных связей, при этом наиболее термостабильным является белок с максимальным числом таких связей. Однако некоторые варианты, будучи более термостабильными, чем нативный фермент или фермент «псевдодикого типа», не обладают ферментативной активностью. Возможно, это обусловливается искажением конформации белковой молекулы при образовании определенных дисульфидных связей.

Хотя создание ферментов с новыми свойствами методами генной инженерии часто представляет собой эмпирический процесс, описанный эксперимент показывает, что этот подход дает вполне реальные результаты.

Замена аспарагина на другие аминокислоты

При высоких температурах остатки аспарагина и глутамина могут дезаминироваться с образованием аммиака. При этом они превращаются в аспарагиновую и глутаминовую кислоты соответственно, что приводит к нарушениям конформации полипептидной цепи и снижению или утрате активности фермента. Эксперименты по замене таких аминокислотных остатков демонстрируют повышение термостабильности фермента.

Уменьшение числа свободных сульфгидрильных групп

Некоторые чужеродные белки, синтезируемые рекомбинантными системами, оказываются менее активными из-за образования димеров и более высокомолекулярных неактивных комплексов. Эксперименты показывают, что замены одного или нескольких цистеиновых кодонов на, например, сериновые приводит к синтезу белка, не образующего мультимерных комплексов.

Повышение ферментативной активности

С помощью сайт-специфического мутагенеза можно не только повысить стабильность ферментов, но и изменить их каталитическую активность. Для этого необходимо располагать детальной информации о геометрии его активного центра. В этом случае можно предсказать, какие замены необходимо произвести для изменения специфичности фермента к субстрату.

Возможности такого подхода иллюстрируют результаты эксперимента по изменению специфичности связывания субстрата тирозил-тРНК-синтетазой. Этот фермент на первом этапе активирует тирозин связыванием с АТР, на втором этапе тирозиладенилат присоединяется к тРНК с высвобождением АМР. С использованием компьютерного моделирования были предсказаны замены, которые могут повлиять на субстратную специфичность. Чтобы проверить правильность прогнозов, с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза в ген тирозил-тРНК-синтетазы были внесены специфические мутации. Остаток треонина в положении 51 был заменен на остаток аланина или пролина. Чтобы охарактеризовать получившиеся ферменты, определили их каталитические константы. В некоторых случаях изменения оказались даже значительнее, чем ожидалось. Так, для Ala-51-фермента константа связывания (К_М) с АТР уменьшилась примерно в два раза без значительного изменения каталитической константы, а для фермента с Pro-51 – более чем в 100 раз.

Таким образом, сродство ферментов к субстрату и каталитическую активность ферментов можно повысить, внося соответствующие изменения в клонированный ген.

Изменение потребности ферментов в кофакторах

Изменение потребности фермента в кофакторе продемонстрировано на примере модификации субтилизина. Субтилизины – сериновые протеиназы, которые секретируются грамположительными бактериями и используются в качестве биодеградируемого детергента. Все субтилизины прочно связывают один или несколько атомов кальция, повышающих их стабильность. Субтилизины используются в таких промышленных процессах, где участвуют в больших количествах соединения, хелатирующие металлы, в том числе кальций и в таких условиях субтилизины быстро теряют свою активность. С использованием рентгеноструктурных данных о структуре белка, был получен модифицированный продукт с небольшой делецией в области, отвечающей за связывание кальция. Мутантный белок сохранял конформацию. Затем было внесено несколько аминокислотных замен, предположительно повышающих стабильность фермента. Значение двух стабилизирующих мутаций подтвердилось. В результате был получен мутантный субтилизин, обладающий кинетическими свойствами, сходными с таковыми исходного субтилизина. Кроме того, новый субтилизин в отсутствие кальция был почти вдвое более стабилен, чем исходный фермент даже в присутствии кальция.

Полученные эксперименты показывают что, несмотря на трудоемкость этих экспериментов, с помощью методов генной инженерии можно эффективно изменять свойства ферментов.

Изменение специфичности фермента

Сайт-специфический мутагенез используют в основном для улучшения уже существующих свойств ферментов, более редкие эксперименты касаются изменения специфичности ферментов. Например, удается на основе одной сайт-специфической эндонуклеазы получить фермент с иной специфичностью. Несмотря на большое число известных рестриктаз, крупнощепящих ферментов (узнающих 8-нуклеотидные сайты и расщепляющие ДНК на большие фрагменты) не так уж много. Поиск новых рестриктаз – достаточно непростая задача, поэтому для получения рестриктаз с необходимой специфичностью предложены альтернативные генно-инженерные подходы.

В работах по созданию новых рестриктаз использована малоспецифичная рестриктаза FokI и «цинковые пальцы» ‒ фрагмент белковой молекулы, связывающие ионы Zn²⁺ и присоединяющиеся к определенным последовательностям ДНК. Химерный белок включал эти компоненты в своем составе плюс линкерный участок для придания гибкости молекуле. В результате удалось получить рестриктазы с необходимой специфичностью.