Убиквитин – белок, маркирующий белки для деградации. Строение 26S протеосомы

В цитозоле эукариот селективную деградацию белков осуществляют большие мультикаталитические комплексы с мол. массой около 2 млн., называемые 26S-протеасомами (то есть протеиназами, являющимися крупными частицами – “сомами”). Мишенями 26S-протеасом являются белки, вовлеченные во многие внутриклеточные процессы (регуляция метаболизма, дифференцировка клеток, контроль клеточного цикла, ответ на стресс и др.) или дефектные белки, возникающие в результате мутаций или посттрансляционных повреждений. При этом белки-мишени предварительно подвергаются модификации небольшим белком – убиквитином, состоящим из 76 а.о. 26S-протеасома – это сложный комплекс (рис. 4.4.3), образованный 20S-протеасомой, играющей роль протеолитического ядра, и двумя регуляторными комплексами, так называемыми активаторами протеасомы Р700 (или 19S-комплексами), которые обеспечивают проявление ферментативной активности и определяют субстратную специфичность 26S-комплекса.

Центральная часть 26S-протеасомы 20S-протеасома представляет собой цилиндрическую частицу, которая состоит из четырех семичленных колец. Кольца расположены друг над другом и формируют обширную внутреннюю полость. 20S-протеасомы эукариот содержат более десяти различных типов субъединиц, которые делятся на два семейства (a и b). Наружные кольца образованы a-субъединицами, а внутренние – b-субъединицами.

In vitro 20S-протеасома обладает широким спектром пептидгидролазной активности. Каждое кольцо из семи b-субъединиц содержит три активных центра, проявляющих различную первичную специфичность: химотрипсино-, трипсино- и каспазоподобную, т.е. в белках-мишенях атакуются пептидные связи, образованные, соответственно, гидрофобными, положительно заряженными или дикарбоновыми аминокислотами. При этом каталитически активным остатком каждого из активных центров является N-концевой остаток треонина – Thr1 (так же, как это было установлено для HslUV-протеиназы).

Протеасома осуществляет процессивную деградацию белковых субстратов с образованием пептидных продуктов размером от 3 до 22 а.о. В последнее время обнаружен феномен аллостерической взаиморегуляции активных центров, обладающих различной специфичностью. Функционирует ли 20S-протеасома in vivo – неизвестно.

Рис. 4.4.3. Строение и сборка 26S-протеасомы.

26S-протеасома образуется при АТР-зависимой ассоциации 20S-протеасомы и регуляторного 19S-комплекса, включающего около 20 различных субъединиц. Этот комплекс обладает АТРазной активностью и выполняет функции селективного распознавания субстратов и взаимодействия с ними, активации пептидазной активности 20S-комплекса, обеспечения сборки полного 26S-комплекса и др. 19S-комплекс содержит, по крайней мере, 6 различных АТРазных субъединиц, которые принадлежат к белкам ААА-типа (так же как и описанные выше Lon- и FtsH-протеиназы прокариот). Значение такого разнообразия АТРазных субъединиц и роль каждой из них не выяснены. Помимо АТРазных субъединиц 19S-комплекс содержит и другие субъединицы, не обладающие АТР-связывающей способностью. Роль этих субъединиц может заключаться в обеспечении взаимодействия с 20S-протеасомой и в ее активации, высвобождении полиубиквитиновых цепей и их гидролизе, поддержании структуры 26S-комплекса, взаимодействии с субстратами и их презентации 20S-протеасоме.

Процессу деградации белков протеасомой (рис. 4.4.4) предшествует селективная модификация мишеней путем ковалентного присоединения убиквитина. Сначала происходит активация С-концевого остатка глицина в молекуле убиквитина, катализируемая специфическим убиквитинактивирующим ферментом Е1, и связывание активированного убиквитина с убивитинпереносящим ферментом Е2. Затем при помощи убиквитинлигазы Е3 образуется изопептидная связь между С-концевым остатком глицина убиквитина и аминогруппой внутреннего остатка лизина белка-мишени.

Рис. 4.4.4. Убиквитин-зависимая деградация белков 26S-протеасомой.

Другая группа Е2-ферментов катализирует образование полиукбивитиновых цепей путем связывания каждой последующей молекулы убиквитина с e-аминогруппой остатка Lys48 предыдущей. И уже полиубиквитинилированные белки-мишени подвергаются быстрой деградации 26S-протеасомой, сопровождающейся отщеплением убиквитина. Все стадии этого процесса АТР-зависимы.

Фактически распознавание белка-мишени осуществляется убиквитин-лигазой – ферментом Е3, однако, по какому принципу происходит отбор мишени, до сих пор не ясно. В настоящее время предложено несколько вариантов так называемых сигналов, определяющих белки, подлежащие селективному протеолизу. Согласно N-концевому правилу скорость деградации белка зависит от природы его N-концевой аминокислоты, при этом одни аминокислоты считаются дестабилизирующими, а другие – стабилизирующими. Другой молекулярной детерминантой деградации белка считаются PEST-сигналы – фрагменты последовательности белка-мишени, обогащенные остатками пролина (P), глутаминовой кислоты (E), серина (S) и треонина (T). Обнаружено также два варианта специфических фрагментов последовательностей (обозначаемых как “destruction box” – RXALGXIXN и “destabilizing tail” – AANDENYALAA), являющихся сигналами деградации. Однако ни один из этих сигналов не носит обобщающего характера. Общие принципы селективного отбора субстратов еще не сформулированы, а может, они вообще не существуют.

Следует отметить, что, несмотря на более сложную организацию, 26S-протеасома обнаруживает некоторое структурное подобие с АТР-зависимыми протеиназами прокариот Clp-семейства. Действительно, структура ClpP и HslV подобна структуре внутреннего ядра из b-субъединиц 20S-протеасомы, однако при этом только HslV проявляет сходство по первичной структуре с b-субъединицей. Методом электронной микроскопии показано (рис. 4.4.5), что Clp-протеиназы и 26S-протеасома имеют сходную архитектуру: центральный элемент обоих комплексов представляет двухкольцевую структуру с осью симметрии 7 порядка, фланкированную с двух сторон олигомерными АТРазными компонентами. Такое структурное сходство позволяет предполагать сходство в основных биохимических механизмах, посредством которых эти ферменты связывают, разворачивают и переносят белковые субстраты к протеолитическим активным центрам. Обладают ли функционально активные олигомеры Lon- и FtsH-протеиназ каким-либо структурным сходством с Clp-протеиназами и протеасомами, в настоящее время не известно, поскольку четвертичная структура их еще не определена.

Рис. 4.4.5. Сопоставление строения ClpAP-протеиназы и 26S-протеасомы.

Ферменты, родственные протеиназам ААА-семейства прокариот, также были сравнительно недавно обнаружены в митохондриях клеток эукариот – это Pim1-протеиназа (аналог Lon), m-AAA(Yta10h/Yta12p)-протеиназа и i-AAA(Yme1p)-протеиназа (обе – аналоги FtsH).

Протеиназа Pim1 участвует в формировании дыхательных комплексов в митохондриях, и в регулируемом протеолизе митохондриальных белков. m- и i-AAA-Протеиназы вовлечены в деградацию свободных продуктов митохондриальной трансляции во внутренней мембране и необходимы для формирования системы окислительного фосфорилирования.

Таким образом, селективный внутриклеточный протеолиз, осуществляемый олигомерными АТР-зависимыми протеиназами, обеспечивает контроль качества функциональных белков и поддержание необходимого уровня их в клетке. Несмотря на значительные успехи, достигнутые в исследовании энергозависимого протеолиза, многие его аспекты остаются невыясненными. В первую очередь это касается природы селективности, реализуемой при отборе ферментом субстрата-мишени, и механизма сопряжения протеолиза и гидролиза АТР.

Осуществление функции гидролиза белковых субстратов исключительно полноразмерными энергозависимыми протеиназами может быть обусловлено участием их АТРазных компонентов (субъединиц или доменов) либо в селективном отборе белков-мишеней с последующим изменением их пространственной структуры (“разворачивание”) и транслокацией их к протеолитическим центрам, либо в активации собственно протеолитических центров фермента, либо в совместном действии указанных факторов. Дальнейший прогресс в выяснении механизмов селективного внутриклеточного протеолиза, по-видимому, во многом связан с исследованием взаимовлияния АТРазного и пептидгидролазного центров в процессе их функционирования и с изучением влияния конформационного состояния как фермента, так и субстрата на каталитическую активность каждого центра.