Материалы и оборудование

Для постановки опыта: монолит с растениями или вегетационный сосуд с растениями, пинцеты, ножницы, часовые стекла, 6 колб емкостью 250 мл, содержащих по 100 мл стерильной водопроводной воды (одна из них с добавлением песка 3-5 г), крючки из проволоки, стерильные градуированные и моровские пипетки на 1 мл, стерильные шпатели, стерильные чашки Петри, МПА в пробирках, водяная баня, треножник.

Для результатов опыта: микроскопы и все необходимое для приготовления препаратов и микроскопирования.

РАБОТА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ СВОБОДНОЖИВУЩИХ И СИМБИОТИЧЕСКИХ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ

Цель работы - ознакомиться с методами выделения чистых культур азотобактера, клостридиума и клубеньковых бактерий, со способом определения азотфиксирующей активности (эффективности) клубеньковых бактерий.

Ход работы

1. Выделение чистой культуры азотобактера. Для получения накопительной культуры азотобактера в колбы Эрленмейра на 100 мл наливают 30 мл жидкой среды Бейеринка (г/л водопроводной воды): маннит (можно глюкозу) - 20, К₂НРО₄ - 0,2, СаСО₃ - 5, смесь микроэлементов по Федорову - 1 мл, MgSО₄• 7Н₂О - 0,2 мл, добавляют 1/3 чайной ложки почвы. Колбы помещают в термостат при 28-30⁰.

Через 5-6 дней инкубации на поверхности среды образуется пленка. После исследования мазка (из пленки) под микроскопом делают посев на агаризованную среду Эшби (г/л водопроводной воды): маннит - 20, К₂НРО₄ - 0,2, MgSО₄• 7Н₂О - 0,2, NaCl- 0,2, K₂SО₄ - 0,1, СаСО₃ - 5, агар - 20.

Через 3-5 дней инкубации из образовавшихся слизистых прозрачных колоний азотобактера делают фиксированный крашеный препарат и микроскопируют. Азотобактер имеет вид попарно соединенных крупных овальных, шаровидных или коротких палочковидных клеток. По мере развития они становятся эллипсовидными, попарно сцепленных клеток становится все меньше и меньше, часто клетки окружены капсулой, которая обычно плохо прокрашивается и располагается в виде ореола вокруг клетки.

2. Выделение чистой культуры Clostridium методом Емцева.Сначала получают накопительную культуру клостридиума, для чего колбы Эрленмейера на 100 мл заполняют на 2/3 жидкой средой Виноградского, добавляют 1/3 чайной ложки почвы и ставят в термостат с температурой 35-30⁰.

Через несколько дней отмечается помутнение среды и обильное образование газов. На поверхности среды обычно развиваются поглощающие кислород аэробные азотфиксаторы. Полученную накопительную культуру пастеризуют (колбы прогревают в течение 5-10 мин при температуре 80-90⁰ в водяной бане) и делают высев на агаризованную среду Емцева: картофельно-морковного отвара с добавлением глюкозы - 20 г, К₂НРО₄ - 1, пептона - 5, СаСО₃ - 40, MgSО₄·7Н₂О - 0,5, NaCl, MnSО₄ и FeSО₄ - следы, дрожжевого автолизатора - 0,02 мл и агара - 6 г. Отвар готовят так: 0,5 кг очищенного картофеля и 0,5 кг моркови заливают 2 л дистиллированной воды, кипятят 10 мин, фильтруют, затем доводят дистиллированной водой до первоначального объема.

Просмотр клеток Clostridium проводят методом раздавленной капли с добавлением под покровное стекло раствора Люголя. Клетки Clostridium обычно содержат гранулезу, которая в присутствии раствора Люголя приобретает сине-фиолетовый цвет.

3. Выделение чистых культур клубеньковых бактерий из клубеньков растения-хозяина.От тщательно промытого в водопроводной воде корня бобового растения отрезают наиболее крупные розовые клубеньки, промывают в 3-4 порциях стерильной воды и опускают в чашку Петр и с 3-5%-ным раствором перекиси водорода.

Через 5 мин с помощью фламбированного пинцета клубеньки переносят последовательно в две чашки Петри со стерильной водой и затем в чашку Петри со спиртом. Через 1 мин клубеньки вынимают фламбированным пинцетом из спирта, обжигают и помещают в стерильную чашку Петри (пустую). Стерильным ножом разрезают клубенек, бакте­риологической петлей берут из внутренней части клубенька мазок, переносят в каплю стерильной воды, помещенную в чашку Петри на поверхность агаризованной питательной среды. Размазывают шпателем каплю по поверхности среды и этим же шпателем делают посев последовательно на двух-трех пластинах (истощающий посев). Засеянные чашки инкубируют при 26⁰ в течение 3-5 сут. Для выделения активных культур клубеньковых бактерий лучше использовать клубеньки растений в фазу бутонизации - начала цветения.

Для выделения и культивирования клубеньковых бактерий, особенно быстрорастущих, наиболее часто используют бобовый агар, приготовленный из 1 л бобового отвара с добавлением сахарозы – 2 г, КН₂РО₄ - 1, MgSО₄·7Н₂О - 0,3, агара - 15 г. Бобовый отвар готовят так: 50 г бобов (белой фасоли или гороха) заливают 1 л водопроводной воды и варят до набухания и растрескивания кожуры (бобы не должны развариваться). Отвар фильтруют через марлю (вату), доводят до 1 л. В горячем бобовом агаре устанавливают рН в пределах 7,0, добавляя соду, затем агар стерилизуют при 120⁰ в течение 30 мин.

Для медленно растущих клубеньковых бактерий рекомендуют среду Лазаревой (в г/л водопроводной воды): манит (или сахарозу) – 10, КН₂РО₄ – 0,5, NaCl – 0,2, MgSО₄·7Н₂О - 0,2, дрожжевую воду (рН 6,8) – 100 мл, MnSО₄ – 5 мг, NH₄MoO₄ – 2 мг.

Быстрорастущие клубеньковые бактерии появляются на 3-4-е сут, медленнорастущие - на 7-9-е. Появление колоний на 1-2-е сут свидетельствует о загрязнении культуры. Колонии быстрорастущих культур клубеньковых бактерий (клевера, люцерны, вики, гороха, кормовых бобов) беловатые, часто полупрозрачные, слизистые, с ровными краями, умеренно выпуклые. С течением времени они разрастаются по поверхности агара. Колонии медленнорастущих культур клубеньковых бактерий (сои, люпина) мельче, более выпуклые, менее прозрачные, реже полупрозрачные, менее слизистые, чаще молочного цвета, нередко парафиноподобные по консистенции.

При исследовании под микроскопом чистой культуры клубеньковых бактерий на препарате в раздавленной капле (живые клетки) обнаружено, что они очень подвижны, часто каждая клетка совершает вибрирующие, трепещущие движения, занимая то вертикальное, то горизонтальное положения (по отношению к глазу исследователя). Клетки полиморфны, в основном мелкие. На фиксированных, окрашенных фуксином (лучше эритрозином) препаратах четко просматривается зернистость (опоясанность) протоплазмы клеток.

4. Определение активности (или эффективности) клубеньковых бактерий.Активность (или эффективность) клубеньковых бактерий проявляется в симбиозе. Критерием активности служит результат их влияния на урожай растения-хозяина и количественное содержание в растениях азота (хотя в последние годы доказана способность клубеньковых бактерий фиксировать азот в чистых культурах). В связи с этим определение биомассы растений, инокулированных клубеньковыми бактериями, и содержание в зеленой массе общего азота следует проводить в условиях лабораторного или вегетационного опыта.

При постановке лабораторного опыта предварительно простерилизованные семена высевают в высокие большие пробирки (6-7 пробирок высотой 50-60 см) или большие конические колбы с питательной средой следующего состава (г/л дистиллированной воды): К₂НРО₄ - 1,0, СаСО₃ - 0,5, MgSО₄ - 1,0, FeSО₄, Н₃ВО₃ и MnSО₄ - следы, агар - 1,0. Среду разливают слоем в 3-4 см, пробирки (колбы) закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120⁰ в течение 20 мин. Семена стерилизуют концентрированной серной кислотой, налитой в коническую колбу на 0,7-1 л. Мелкие семена погружают на 1-2 мин, крупные - на 3-5 мин. Затем кислоту сливают и в колбу сразу же быстро вливают большую порцию стерилизованной водопроводной воды, потому что если приливать воду медленно или в небольшом количестве, семена могут перегреться. Воду меняют несколько раз. После прорастания семян их переносят стерильным пинцетом в пробирки (колбы) со средой и туда же вносят по 1 мл суспензии клубеньковых бактерий. Суспензию получают так: в пробирку с культурой клубеньковых бактерий (на бобовом агаре) наливают 10 мл стерилизованной водопроводной воды и бактериологической петлей соскабливают колонию клубеньковых бактерий с поверхности агара и тщательно размешивают с водой до получения однородной суспензии.

Растения выращивают при естественном или искусственном освещении и по мере их развития наблюдают за образованием клубеньков, массой растений и содержанием азота. Контролем служат растения, не бактеризованные клубеньковыми бактериями. Общий азот в исследуемых растениях определяют микрометодом Кьельдаля.

Для оценки азотфиксирующей активности бобово-ризобиальных сим биотических бактерий ацетиленовым методом растения выращивают в пробирках (2 пробирки высотой 20-30 см) с отростком, на который надевают тонкий резиновый шланг, герметически закрытый на конце стеклянной палочкой. Пробирки на 1/4 заполняют средой (г/л): KCI­0,7; КН₂РО₄ – 0,3; К₂НРО₄ - 0,3; MgSО₄^.7Н₂О - 0,5; CaSО₄ - 0,5; FeCl₂ - 0,04; агар - 8. Стерилизацию семян и инокуляцию клубеньковыми бактериями проводят так же, как и в предыдущем опыте. Нитрогеназную активность определяют после введения в пробирки 0,5 мл ацетилена (см. Определение азотофиксирующей активности в чистых или накопительных культурах).