Экспрессия рекомбинантных генов в эукариотических системах

При экспрессии эукариотических генов в бактериальных клетках часть рекомбинантных эукариотических белков и некоторые прокариотические белки при высоком уровне биосинтеза переходят в нерастворимое состояние, образуя так называемые тельца включения. Это связано с отсутствием в клетках прокариот систем, обеспечивающих посттрансляциюнные модификации эукариотических белков, происходящие в определенных компартментах эукариотических клеток:

• образование дисульфидных связей (неправильно уложенный белок может оказаться нестабильным и неактивным);

• протеолитическое расщепление предшественника, удаление определенного участка полипептидной цепи с образованием функционального белка;

• гликозилирование: основная модификация, благодаря которой белки приобретают стабильность, или особые свойства;

• модификация аминокислот в составе белка: фосфорилирование, ацетилирование и др.

Все эти модификации структуры белка, а также правильное сворачивание белковой молекулы (фолдинг), которое в клетках эукариотов осуществляют шапероны, влияют на его растворимость, стабильность и биологические функции. Поскольку в бактериальных клетках соответствующие системы посттрансляционных модификаций белков отсутствуют, в них не могут быть получены биологически полноценные рекомбинантные эукариотические полипептиды, что накладывает ограничения на использование бактерий в биотехнологии. Поэтому используют системы эукариотических клеток: дрожжей, насекомых, животных и растений, в геном которых рекомбинантные гены вводятся с помощью трансфекции .

Выбранную эукариотическую систему экспрессии проверяет на наличие всех необходимых условий для требующейся в каждом конкретном случае посттрансляционной модификации и фолдинга продукта вводимого рекомбинантного гена.

Эукариотические экспрессирующие векторы, как и их прокариотические аналоги должны содержать в структуре следующие функциональные модули (рис. 56):

• эукариотический селективный маркер;

• эукариотический промотор;

• соответствующие эукариотические сайты терминации транскрипции и трансляции;

• сигнал полиаденилирования мРНК.

Рис. 56. Обобщенная структура эукариотического экспрессирующего вектора

эукариотический транскриптон с промотором (Р), множественным сайтом клонирования (МСК) и сигналами терминации и полиаденилирования (Т); эукариотический селективный маркер (СМ^euk); сайт инициации репликации, функционирующий в клетках эукариот (ori^euk); сайт инициации репликации, функционирующий в E. coli (ori^Е); селективный маркер E. coli (Аmр^г).

Если вектор функционирует как плазмида, реплицикация которой не зависит от хромосомы, то он должен содержать сайт инициации репликации, функционирующий в хозяйской клетке. Если же вектор предназначен для встраивания в хозяйскую хромосомную ДНК, то для обеспечения рекомбинации он должен нести последовательность, гомологичную определенному участку хромосомной ДНК хозяина (хромосомный сайт интеграции). Поскольку технически многие операции с рекомбинантными ДНК сложнее проводить в клетках эукариот, чем прокариот, большинство эукариотических векторов сконструированы как челночные. Это значит, что эти векторы несут два типа сайтов инициации транскрипции и два типа селективных маркерных генов, одни из которых функционируют в Escherichia coli, a другие — в эукариотических хозяйских клетках. Такие векторные системы экспрессии разработаны для дрожжей, насекомых и клеток млекопитающих.