Метод микрокультуры.

Метод основан на асептическом культивировании одиночных клеток в капле жидкой среды в специально сконструированных микрокамерах.

Для этого под микроскопом одиночные клетки отбирают микропипеткой и помещают на питательную среду в микрокамеры. При этом объем питательной среды должен быть минимальным (микрокапли объемом 20 мкл). Этот метод открывает широкие возможности для наблюдения за делением и ростом одиночных клеток с использованием микрофотографии.

2. Метод пластинок (метод Плейтинга) - заключается в высеве клеток в обогащенную агаризованную питательную среду. Что такое «обогащенные среды»? это питательные среды – с повышенным содержанием АК, витаминов, гидролизата казеина (среда Као).

Для этого готовую агаризированную среду (с удвоенным % агара - 1,4-1,6%) нагревают для расплавления агара и остужают до +35°С (?) (чтобы не травмировать клетки). Суспензию одиночных клеток отливают в стакан и в соотношении 1:1 смешивают с питательной средой. Полученную смесь разливают в чашки Петри очень тонким слоем (1-2 мм). Чашки Петри запечатывают парафилмом и культивируют во влажной камере (с влажностью 70%). Через 2-3 недели их просматривают, определяют рост колоний и эффективность высева. Как правило, эффективность образования колоний при таком способе очень низка и равна 0,3 – 0,5 %.

Кроме того, для стимуляции деления отдельных клеток используют также гомологичную ткань «няньку» (кормящий слой).

3. В основе метода культуры нянек лежит использование активно делящихся каллусных культур (нянек) для инициации роста одиночных клеток. Для создания «кормящего слоя» берут каллус того же вида растения, что и одиночная клетка или близкого вида в экспоненциальной (?)фазе ростового цикла.

Выращивание одиночных клеток тканями-няньками возможно несколькими способами:

1). Кусочек фильтровальной бумаги, смоченный в питательной среде помещают на поверхность хорошо растущей в колбе ткани-няньки. Через 2-3 дня на фильтр переносят пипеткой одиночные клетки. В чашку необходимо периодически добавлять жидкую питательную среду, чтобы фильтровальная бумага была смоченной. По мере старения ткани-няньки фильтр можно переносить на свежую ткань-няньку или по мере роста колоний их переносят для доращивания на свежую агаризованную среду в колбу.

2). В чашку Петри с питательной средой и кусочками ткани-няньки помещают ванночки из нержавеющей стали, размером 50 х 50 мм (на ножках) с перфорированным дном, на которое кладут фильтровальную бумагу, а сверху капают суспензию с одиночными клетками. Объем среды в ванночках и чашках должен быть одинаковым и не должен превышать в толщину 1-2 мм (20 мл среды в чашках и 3 мл среды в ванночках). По мере роста колоний их снимают и переносят на свежую среду в колбу.

Используя одноклеточное клонирование можно отбирать отдельные мутантные клетки, обладающие полезными признаками – устойчивые к болезням, абиотическим стрессам, с необычным числом хромосом, что и используется в клеточной селекции.