Денверская классификация хромосом и их Парижская номенклатура.

Наиболее простой способ окрашивания хромосом красителем Гимза или 2%-ым ацетоорсеином, или 2%-ым ацетокармином. При этом хромосомы окрашиваются целиком, равномерно и интенсивно. Окрашенные таким образом хромосомы, согласно Денверской классификации (I960), располагались в идиограмме в зависимости от их длины и нумеровались по парам от 1 до 23. Тогда же Патау предложил разбить 23 пары хромосом на 7 групп от А до G с учетом расположения центромеры. Важным признаком, уточняющим форму хромосомы, стал центромерный индекс: отношение длины короткого плеча к длине всей хромосомы, выраженное в %. Комплекс этих параметров позволял с немалой степенью точности распределить хромосомы по группам, но идентифицировать их, особенно в группах В, С, D, F и G, было невозможно.

Однако уже при стандартном (рутинном) равномерном окрашивании хромосом замечали, но оставили без внимания, некоторую неоднородность в плот­ности окрашивания по длине хромосом. И только позже (1968 г.), когда Касперсон с сотрудниками обнаружили, что после обработки акрихин-ипритом флуоресценция по длине хромосом распределена не равномерно, а в виде сегментов, они показали, что каждую хромосому можно надежно идентифицировать с помощью такого метода дифференциального окрашивания, ибо расположение сегментов для каждой хромосомы строго специфично. Вскоре стало ясно, что очень сходный рисунок сегментации хромосом можно получить и с помощью красителя Гимза, дополнив окрашивание некоторыми приемами. Впоследствии при разных способах обработки хромосом были обнаружены разные типы сегментов.

На Парижской конференции по стандартизации и номенклатуре хромосом человека (1971) все полученные к тому времени данные по дифференциальному окрашиванию хромосом были сопоставлены и оказалось, что все методы в принципе выявляют одни и те же структуры, но каждый специфичен в отношении определенных сегментов. И обозначать различные типы сегментов решили по методам, с помощью которых они выявляются.

Q - сегменты - флуоресцирующие после окраски акрихин-ипритом;

G - сегменты (Гимза) - выявляются при окрашивании красителем Гимза в сочетании с дополнительными процедурами; Q и G сегменты идентичны, но в большинстве лабораторий предпочитают этот метод, т.к. он не требует использования флуоресцентного микроскопа и эти препараты дольше хранятся; однако, только с помощью Q-метода можно идентифицировать Y-хромосому человека даже в интерфазном ядре;

R - сегменты - окрашиваются после контролируемой тепловой денатурации, располагаются между Q и G - сегментами;

С - сегменты - конститутивный гетерохроматин, располагается в прицентромерных районах обоих плечей хромосомы;

Т - сегменты - расположены в теломерных (концевых) районах хромосом.

Химическая природа дифференциального окрашивания еще только исследуется. Обсуждаются две основные гипотезы: первая исходит из того, что различные участки хромосом человека отличаются по количественному содержанию пар оснований аденин - тимин и гуанин - цитозин. Отсюда разная сте­пень усвоения ими красителей. В частности, блоки с большим содержанием пар А-Т связываются преимущественно с акрихин-ипритом, следовательно, Q-сегменты соответствуют участкам, богатым А-Т - парами; R-сегменты соответствуют участкам, богатым Г-Ц - парами, которые более устойчивы к тепловой денатурации - это, однако, не объясняет всех особенностей сегментации хромосом. Вторая гипотеза, белковая, исходит из данных о том, что предварительная протеолитическая обработка перед окрашиванием красителем Гимза индуцирует появление G-сегментов, а так как разные по составу участки ДНК связаны с разными белками, можно полагать, что рисунок сегментации зависит от особенностей комплекса ДНК - белок.

18.Биосинтез белка. Транскрипция, процессинг, трансляция.

БИОСИНТЕЗ БЕЛКА

Биосинтез белка – сложный многостадийный процесс синтеза полипептидной цепи из аминокислотных остатков, происходящий на рибосомах в клетках живых организмов с участием различных молекул РНК (и-РНК, т-РНК и р-РНК).

Реализация генетической информации о структуре определенного белка включает 4 стадии: транскрипция, процессинг, трансляция и посттрансляционные изменения.

Рис.58. Этапы биосинтеза белка.

① ТРАНСКРИПЦИЯ [лат. “transcriptio” – переписывание] – это первый этап реализации генетической информации, при котором в ядре происходит считывание генетической информации о структуре белка, зашифрованной в молекулах ДНК, и запись (переписывание) этой информации на специальный посредник – про-и-РНК (гя-РНК или транскрипт). Транскрипция – это пример реакции матричного синтеза в клетке, где в роли матрицы выступает небольшой фрагмент ДНК, соответствующий одному гену у эукариот.

Две цепи ДНК в гене различаются по функциональной роли: одна из них является кодирующей (5-концом слева), а вторая – матричной(3-концом слева).

В связи с тем, что РНК-полимераза способна собирать полинуклеотид лишь от 5′- к 3′-концу, матрицей для транскрипции может служить только та цепь, которая обращена к ферменту 3′-концом (эту цепь называютматричной или кодогенной). Считывание гена происходит с матричной цепи ДНК (3'→5'), следовательно, при транскрипции воспроизводится в структуре РНК генетическая информация кодирующей цепи ДНК. Сборка рибонуклеотидов в цепь происходит с соблюдением их комплементарности нуклеотидам ДНК, а также антипараллельно по отношению к матричной цепи ДНК.

Транскрипция ДНК происходит отдельными участками, в которые входит один или несколько генов. Каждый ген состоит из регуляторной части, с которой начинается транскрипция, кодирующей части, где записана информация о структуре белка, и терминирующей части, где завершается транскрипция. Помимо структурных генов, несущих информацию о структуре белков, имеются гены, кодирующие синтез р-РНК, т-РНК, которые обычно представлены в геноме большим числом копий.

Транскрипции подвергается не вся молекула ДНК, а только ее определенный участок – транскриптону эукариот, оперон –у прокариот. У эукариот в состав транскриптона, как правило, входит только один ген. Термины "транскрипционная единица" или "транскриптон" по смыслу близки термину "ген", но они не всегда совпадают. Транскрипционные единицы прокариот, как правило, заключают в себе генетическую информацию нескольких генов и называются оперонами. Продуктами транскрипции оперонов являются полицистронные и-РНК, в результате трансляции которых рибосомами образуется несколько белков. Белки, кодируемые полицистронными и-РНК, обычно функционально связаны друг с другом и обеспечивают протекание какого-либо метаболического процесса. Начало транскриптона (оперона) – промотор, конец – терминатор.

Транскрипция осуществляется специальным ферментом РНК-полимеразой, которая узнает начало транскрибируемого участка (промотор), присоединяется к нему, расплетает двойную спираль ДНК и копирует, начиная с этого места, одну из ее цепей. Когда РНК-полимераза достигает конца копируемого участка (терминатора), фермент отделяется от матрицы.

Этапы транскрипции

1. Инициация – это первый этап транскрипции, где у прокариот РНК-полимераза с участием δ-фактора узнает промотор и присоединяется к нему. Промотор у прокариот длиной около 80 пар нуклеотидов содержит две характерные шестинуклеотидные последовательности, которые распознаются РНК-полимеразами и служат местом их присоединения.

Присоединение РНК-полимеразы к промотору инициирует раскручивание двойной цепочки ДНК и освобождение нуклеотидных связей.

2. Элонгация транскрипции – последовательное присоединение свободных нуклеотидов к «смысловой цепи» ДНК по принципу комплементарности (А – У, Г – Ц) и соединение их в единую цепь при помощи РНК-полимеразы в полирибонуклеотидную цепочку.

РНК-полимераза перемещается вдоль структурных генов оперона, соответственно перемещается и «транскрипционный глазок», синтезируется молекула про-и-РНК, комплементарная матричной цепи ДНК.

Нити ДНК перед транскрипционным комплексом (ДНК – РНК-полимераза – РНК) разделяются, а позади него вновь соединяются, вытесняя 5-конец синтезированной РНК. Средняя скорость транскрипции в клетках у бактерий составляет 30-50 нуклеотидов в секунду на 1 молекулу РНК-полимеразы.

3. Терминация – завершающий этап транскрипции. Сигналом терминации служат специальные ГЦ богатые участки в конце генов. Сила взаимодействия пар ГЦ довольно велика, локальная денатурация таких участков в ДНК происходит трудней. Это замедляет продвижение РНК-полимеразы и служит для нее сигналом к прекращению транскрипции.

У бактерий, специальный белок RhO-фактор также обладает расплетающей активностью и облегчает расхождение цепей РНК и ДНК. Каждая завершенная цепь РНК отделяется от ДНК матрицы в виде свободной одноцепочечной молекулы, в которой число нуклеотидов колеблется от 70 до 10 000.

Обычно на каждом транскрибируемом гене работают несколько молекул РНК-полимеразы, двигаясь друг за другом конвеерным способом. Расстояние между ними в среднем 300-500 н.п. Соответственно с одним геном одновременно связано несколько растущих цепей про-и-РНК.

Продукты транскрипции. В результате транскрипции у эукариот образуются предшественники тех или иных РНК: и-РНК, р-РНК и т-РНК. Про-и-РНК имеют такую же длину, что и транскрибируемый участок ДНК. В них включены спейсеры, экзоны – кодирующие участки, а также интроны, которые подобно межгенным спейсерам не содержат генетической информации. Интронные последовательности нередко образуют «шпильки».

Длина таких про-и-РНК у разных молекул варьирует от 2 тыс. до 20 тысяч нуклеотидов. Данный вид РНК называют гетерогенной ядерной РНК (гя-РНК). Кроме того в про-и-РНК отсутствует на 5-конце колпачок (КЭП), а на 3-конце – поли (А) – фрагмент. Про-и-РНК эукариот несут информацию о синтезе лишь одной полипептидной цепи, т.е. дают при созревании только одну молекулу и-РНК.

② ПРОЦЕССИНГ (СОЗРЕВАНИЕ) – этап формирования функционально активных молекул и-РНК, р-РНК, т-РНК в экспрессии генетического материала с участием s-РНК.

Если у прокариот процессы транскрипции и трансляции идут практически одновременно, то у эукариот эти этапы разделены во времени. Экспрессия гена у эукариот представляет собой сложный и многоступенчатый процесс.

Процессинг р-РНК и т-РНК у эукариот принципиально не отличается от такового у прокариот, в то время как процессинг и-РНК отличается сильно.