Принципи білково-нуклеїнового впізнання

Усі випадки взаємодії численних білків із ДНК можна поділити на дві категорії: неспецифічне зв'язування білка з ДНК будь-якої послідовності (характерна константа зв’язування K ~ 10⁵ − 10⁶ л/моль) і специфічне впізнання білком певної послідовності пар основ (із константою ~10⁹ − 10¹⁰ л/моль). Білки, що здійснюють таке впізнання, як правило, взаємодіють і з будь-якою іншою ДНК неспецифічно. Розглянемо на простому прикладі, що практично означають наведені цифри.

Нехай у бактеріальній клітині радіусом 1 мкм міститься 10 молекул певного білка та 4 млн 600 тис. пар основ ДНК, де присутня одна специфічна ділянка (оператор). Виходячи з об’єму клітини, можна легко розрахувати загальні молярні концентрації білка та оператора (скориставшись числом Авогадро). Концентрація комплексу з оператором визначається рівнянням (1.6), де вільні концентрації білка та оператора дорівнюють їхнім загальним концентраціям мінус концентрація комплексу. Звідки, якщо відома K, можна розрахувати концентрацію комплексу.

Якщо білок зв’язується неспецифічно (K = 10⁵ л/моль), відношення концентрації комплексу до загальної концентрації оператора дорівнює 4×10^-4 − оператор практично є вільним від білка. Та якщо замість концентрації оператора використати загальну концентрацію потенційних сайтів зв’язування на ДНК (білок зв’язується будь де), яка є в 4 млн 600 тис. разів вищою (кожна пара основ потенційно може бути початком сайта зв’язування), то відношення концентрації комплексу до загальної концентрації білка дорівнюватиме 0,995 − практично білок увесь час зв’язаний із ДНК.

При специфічному зв’язуванні (K = 10¹⁰ л/моль), відношення концентрації комплексу до загальної концентрації оператора дорівнює 0,97 − десяти молекул білка виявляється достатнім, щоб більшу частину часу оператор був зв’язаним. При цьому з оператором у нашому прикладі в даний момент часу може бути зв’язана лише одна молекула білка, решта перебуває не у вільному стані, а на ДНК, взаємодіючи з нею неспецифічно.

Чим визначається висока специфічність зв’язування? Головне правило білково-нуклеїнового впізнання − відсутність жорстких правил.

Розглянуті різні структурні мотиви білків є різними еволюційними рішеннями для специфічної взаємодії з тією чи іншою послідовністю: існує багато шляхів для того, щоб сформувати білкову поверхню для впізнання послідовності пар основ. Не існує і будь-якого коду впізнання − чіткої відповідності між амінокислотними залишками та парами основ. Але є певні загальні закономірності, частина яких уже має бути зрозумілою з розгляду ДНК-зв’язувальних структурних мотивів. Зокрема, білково-нуклеїновий інтерфейс частіше представлений парою α-спіраль − великий жолобок завдяки хорошій просторовій відповідності між цими двома елементами. Проте використовуються також і β-структура, і перемички між елементами вторинної структури для впізнання пар основ у великому жолобку. Маленький жолобок також використовується для впізнання послідовностей пар основ, причому у випадку взаємодії елементів вторинної структури білка (α-спіраль чи β-структура) із маленьким жолобком така взаємодія супроводжується розкриттям маленького жолобка. Таке розкриття стає можливим унаслідок значної деформації подвійної спіралі (розкручування, вигин, кінк у результаті порушення стекінг-взаємодій).

На поверхні ДНК розташовані фосфатні залишки та донорні / акцепторні групи азотистих основ у жолобках. Саме ці групи й залучаються до контактів з амінокислотними боковими залишками та пептидними групами на поверхні білка. Існує декілька типів контактів (взаємодій) між ДНК і білками: електростатичні взаємодії між позитивно зарядженими амінокислотними залишками та негативно зарядженими фосфатами присутні майже завжди в білково-нуклеїнових комплексах. Зрозуміло, що електростатичні взаємодії відповідають за неспецифічне зв’язування. Як правило, вони додатково стабілізують також і специфічні комплекси. Електростатичне зв’язування білка з нуклеїновою кислотою має цілком ентропійну природу. Висока концентрація негативних зарядів (фосфатів) на поверхні ДНК зумовлює формування навкруг ДНК іонної атмосфери з досить високою локальною щільністю катіонів (рис. 21). Зв’язування позитивно зарядженого білка призводить до визволення частки катіонів у зовнішній розчин, тобто до зростання невпорядкованості (ентропії) у системі. Енергетичний виграш від зв’язування білка (його спорідненість до ДНК) є тим більшим, чим меншою є концентрація солі в розчині, тобто різниця між концентрацією катіонів поблизу від ДНК і на віддаленні від неї.

Рис. 21. Електростатичне зв’язування білка (червоним позначені позитивно заряджені амінокислотні залишки) з ДНК за рахунок визволення неорганічних катіонів.

Водневі зв’язки між донорно-акцепторними групами білка та фосфатами й екзоциклічними групами азотистих основ. Водневі зв’язки,оскільки вони потребують чіткої взаємної орієнтації донора й акцептора, відіграють роль головного фактора специфічного впізнання. Кожна послідовність пар основ утворює в жолобках подвійної спіралі власний патерн донорних і акцепторних груп (рис. 22, див. також рис. 7), який і може впізнаватися поверхнею білка. Слід зазначити,що цей патерн більш варіабельний у великому жолобку, де легше розрізнити пари основ і динуклеотидні контакти − це ще одна причина, чому саме великий жолобок частіше використовується для впізнання.

Деякі амінокислотні залишки здатні утворювати два водневі зв’язки з азотистою основою, наприклад, Arg із гуаніном. Проте Arg контактує й з усіма іншими основами. Чи буде певний залишок залученим до утворення водневого зв’язку, і якого саме, залежить від його орієнтаціїна поверхні. Певні закономірності (своєрідний код, коли залишок певного типу в певному місці утворює зв’язок із певною основою) спостерігаються іноді тільки в межах однієї родини структурних мотивів, алей тоді такі закономірності не мають абсолютного характеру.

Рис. 22. Патерни донорів і акцепторів водневого зв’язку в жолобках подвійної спіралі для зазначеної послідовності чотирьох пар основ.

Водневі зв'язки, опосередковані молекулами води. Вода взаємодіє з поверхнями як білків, так і ДНК. Визволення води з білково-нуклеїнового інтерфейсу вносить додаткову ентропійну складову у стабілізацію комплексу. Але досить часто окремі молекули води можуть залишатися в інтерфейсі, виконуючи роль біфункціональної зшивки − утворюючи водневі зв’язки з білковими групами та фосфатами або групами азотистих основ.

Гідрофобні контакти можуть здійснюватись за участю метальної групи тиміну у великому жолобку (рис. 7), але суттєвішими є гідрофобні взаємодії при інтеркаляції неполярних амінокислотних залишків між парами основ при деформації подвійної спіралі внаслідок занурення елементів вторинної структури білка в маленький жолобок (рис. 18, 19).

Головною умовою реалізації названих контактів між ДНК і білком є взаємна підгонка структури взаємодіючих елементів унаслідок відповідних конформаційних перетворень. Так, шляхом певних конформаційних змін подвійної спіралі (вигини спіралі, зміни твіста тощо) змінюється розмір жолобків, хімічні групи підводяться під водневі зв’язки та міцні електростатичні контакти, збільшується загальна поверхня, що може взаємодіяти з білком. Це означає, що для ефективного впізнання необхідна певна конформація подвійної спіралі та / або певні зміни цієї конформації. І те, й інше визначається послідовністю пар основ. Отже, основою для білково-нуклеїнового впізнання є структурно-динамічний поліморфізм нуклеотидних послідовностей − залежні від послідовності структурні особливості та конформаційна рухливість подвійної спіралі.

При цьому білок також часто потребує певної конформаційної підгонки під подвійну спіраль. Один із прикладів такої, досить значної, конформаційної зміни як у молекулі білка (формування додаткових α-спіралей), так і у молекулі ДНК (вигин подвійної спіралі) при утворенні специфічного комплексу показано на рис. 23. Саме в процесі взаємної конформаційної підгонки білка та ДНК і реалізується специфічний патерн контактів у інтерфейсі між двома молекулами.

Від того, наскільки легко потрібні конформаційні зміни відбуваються при зустрічі конкретного білка з конкретною послідовністю пар основ, залежить ефективність упізнання. Таким чином, головним механізмом упізнання послідовності ДНК білком є структурно-динамічна комплементарність двох молекул.

Рис. 23. Структура ДНК-зв’язувальних доменів димеру репресора лактозного оперона E. Coli у комплексі з неспецифічною ДНК (а, 1OSL) та зі своїм специфічним оператором (б, 1L1M).

Циркулярна ДНК

ДНК майже завжди існує іn vivo у вигляді циркулярної ковалентно-замкненої молекули (прокаріоти) або у формі, що є еквівалентною циркулярній − у вигляді петель, закріплених своїми кінцями на скелетних структурах клітинного ядра (еукаріоти). У молекулі, два кінці якої жорстко зафіксовані або з’єднані один з одним, виникають топологічні обмеження, і це має важливі біологічні наслідки.

Топологія − це розділ математики, присвячений вивченню таких властивостей просторових об’єктів, які не залежать від деформаційцих об’єктів. Центральним поняттям топології циркулярної ДНК є так зване число зчеплень Lk (linking number) двох полінуклеотидних ланцюгів − двох кілець, закручених одне навкруг одного в подвійну спіраль. Число зчеплень визначається як кількість перетинів одним циркулярним контуром поверхні, що натягнута на другий контур. У найпростішому випадку два кільця можна зчепити одне з одним один раз (Lk = 1, рис. 24), і будь-які деформації кілець (за умови збереження цілісності кожного кільця) не змінять цієї величини: кільця не можна ні розвести, ні збільшити ступінь зчеплень. Отже, і це одна з двох важливих властивостей числа зчеплень, Lk системи двох кілець є постійною величиною – топологічним інваріантом, − поки обидва кільця є інтактними (не містять розривів). Легко уявити два кільця, зчеплені одне з одним два (рис. 24) або сто разів, але не може бути двох з половиною зчеплень, тобто Lk є цілим числом. Саме ці дві властивості числа зчеплень і накладають топологічні обмеження на молекулу циркулярної ДНК.

На рис. 24 показано планарну (вісь подвійної спіралі лежить в одній площині) циркулярну молекулу ДНК з Lk = 20. Зрозуміло, що для такої системи Lk дорівнює кількості витків подвійної спіралі. Кількість витків подвійної спіралі позначається як твіст Tw (twist, дорівнює сумі кутів твіста для всіх пар основ, поділеній на 360°, з позначкою «+»” для правої спіралі та «−» − для лівої), тобто для планарної циркулярної ДНК Lk = Tw. Найвигідніший твіст ДНК Tw0 (часто записується також як Lk0) визначається зовнішніми умовами та послідовністю пар основ (типове середнє значення за фізіологічних умов відповідає приблизно 10,5 парам основ на виток подвійної спіралі), тобто зовсім не повинен бути цілим числом. Лише тоді, коли Tw = Tw0 (припустимо, що ця умова реалізується для прикладу на рис. 23, і Tw0 = 20), при замиканні в кільце ДНК набуде найбільш енергетично вигідної планарної форми, у складі якої реалізується мінімальний вигин молекули.

Якщо ж (як це частіше буває) Tw0 не є цілим числом, замикання в кільце (точне зведення кінців обох ланцюгів) є можливим або за рахунок зміни твіста до цілого значення (треба підкрутити подвійну спіраль, щоб виставити один кінець точно напроти одного), або шляхом додаткових вигинів молекули з відхиленням від планарної форми. У будь-якому разі замикання в кільце буде можливим лише за умови деформацій молекули ДНК.

Отже, у загальному випадку, коли Lk (яке має бути цілим числом) не збігається з Tw0, число зчеплень має дві складові згідно з рівнянням Уайта − Фуллера (James H. White, F. Brock Fuller):

Lk = Tw + Wr,

де райзинг Wr (writhing) − параметр, який є мірою відхилення осі подвійної спіралі від планарної конфігурації (для планарного кільцяWr = 0).

Розподіл величини Lk по двох складових залежить від механічних властивостей молекули ДНК: той факт, що Lk ≠ Tw0, означає наявність деформації (відхилення конформації від найвигіднішої) і ця деформація мінімізується, розподіляючись певним чином між зміною твіста

ΔTw = Tw − Tw0

і ненульовим райзингом унаслідок зростання вигину молекули. Отже, загальною мірою деформації є величина

ΔLk = Lk − Tw0 = ΔTw + Wr.

Оскільки зростання райзингу (при зростанні загальні деформації) пов’язане зі спіралізацією осі подвійної спіралі – надспіралізацією (supercoiling), величина ΔLk використовується як міра надспіралізації в циркулярній ДНК. Таким чином, надспіралізація є тим більшою,чим більше Lk відрізняється від Tw0, і чим більша напруга, пов’язана з деформацією, накопичується в ДНК.

Рис. 24. Ліворуч: два кільця з різним числом зчеплень Lk, у тому числі планарна форма циркулярної ДНК з Lk = 20. Праворуч: збільшення чи зменшення ступеня закрутки подвійної спіралі на один оберт призводить відповідно до позитивної чи негативної надспіралізації.

Описане ілюструє рис. 24 на прикладі ДНК із Tw0 = 20. Якщо зробити одноланцюговий розрив, збільшити кількість витків подвійної спіралі на 1 (закрутити подвійну спіраль торсійно) і зашити розрив, відновивши ковалентний зв’язок, то тим самим кількість зчеплень зросте на 1: ΔLk набуде значення +1, яке розподілиться між зміною твіста та райзингом. У цьому випадку кажуть про позитивну надспіралізацію, яка є топологічно еквівалентною зростанню закрутки подвійної спіралі. Відповідно, розкручення подвійної спіралі після розриву та наступне відновлення цілісності ланцюга призведе до негативної надспіралізації з ΔLk = –1.

Однакові циркулярні молекули ДНК, які різняться лише кількістю зчеплень (як три молекули з Lk = 19, 20 та 21 на рис. 24), називаються топоізомерами. Зрозуміло, що практично застосувати описану процедуру для отримання різних топоізомерів досить важко.

Але це можна зробити, здійснивши ензиматичне зшивання ДНК у кільце в різних умовах, що відповідають різним значенням Tw0. Отримані топоізомери будуть відповідати найменш енергетичним формам − таким, для яких значення Lk є максимально наближеними до значень найвигіднішого твіста. Щойно зациклення відбулося, значення Lk залишається незмінним. А зміна умов і нове значення Tw0 приведе до зростання величини ΔLk у негативний чи позитивний бік і, відповідно, надспіралізації.

З іншого боку, значення Lk залишається незмінним лише за умови цілісності обох полінуклеотидних ланцюгів. Якщо внести хоча б один розрив у хоча б один із ланцюгів, два кінці ланцюга в місці розриву отримають свободу обертатися навкруг інтактного ланцюга. У результаті будь-яка надспіралізація і пов’язана з нею еластична напруга зникнуть − відбудеться релаксація циркулярної ДНК. Для негативно надспіралізованої ДНК існує ще один шлях релаксації (принаймні часткової) без розривів − локальне розкручування подвійної спіралі. Припустимо, що лінійна молекула ДНК із Tw0 = 20 (як на рис. 24) може існувати також у формі зі зруйнованим (розплавленим) одним витком подвійної спіралі, тобто з величиною Tw0 = 19. За фізіологічних умов розведення ланцюгів потребує зростання вільної енергії, тобто така форма є неможливою. Але локальне плавлення подвійної спіралі у складі негативного топоізомеру буде супроводжуватись також зниженням вільної енергії за рахунок релаксації, оскільки ΔLk = 19 − 20 = −1 зміниться на ΔLk = 19 − 19 = 0. У результаті, якщо загальна вільна енергія знизиться, локальна дестабілізація подвійної спіралі стане імовірнішою. За таким самим механізмом − енергетично невигідне конформаційне перетворення стає вигідним за рахунок того, що знімає негативну надспіралізацію в кільці − у негативно надспіралізованій ДНК (за фізіологічних умов!) відбуваються й інші конформаційні перетворення (наприклад, перехід в Z-форму, яка характеризуються розкрученням подвійної спіралі порівняно з В-ДНК). Оскільки більшість функціональних процесів, що відбуваються на ДНК, потребують локального руйнування подвійної спіралі, зрозуміло, що негативна надспіралізація активує ці процеси, полегшуючи таке руйнування на певних найменш стабільних ділянках.

З іншого боку, функціональні процеси (у першу чергу, транскрипція і реплікація) самі призводять до виникнення надспіралізації. Проходження такого процесу пов’язане з пересуванням (транслокацією) уздовж ДНК того чи іншого ферменту (транслокази), який локально руйнує подвійну спіраль. Такими транслоказами є РНК і ДНК-полімерази, які розглядатимуться далі, а також інші ферменти. Оскільки молекула ДНК − спіраль, пересування транслокази має супроводжуватись або її обертанням навкруг осі подвійної спіралі (на кшталт обертання гайки навкруг гвинта), або прокручуванням самої подвійної спіралі (обертанням гвинта в гайці). Саме друга можливість і реалізується, оскільки транслоказа працює завжди у складі величезного мультибілкового комплексу − “гайка” є надто масивною. Крім того, транслоказа може бути заякореною на скелетних структурах, що робить її обертання взагалі неможливим. Якщо (як це має місце у клітині) кінці ДНК жорстко зафіксовані на тих самих скелетних структурах і не можуть обертатися, транслокація буде створювати топологічні проблеми (рис. 25). У процесі пересування вздовж ДНК транслоказа руйнує подвійну спіраль попереду від себе й відновлює її позаду. Локальне розкручування подвійної спіралі попереду транслокази має бути компенсованим позитивною надспіралізацією, відновлення спіралі (закручування) − надспіралізацією негативною. У результаті попереду й позаду від транслокази виникають дві “хвилі” надспіралізації протилежного знаку (рис. 25).

Рис. 25. Дві хвилі надспіралізації у процесі роботи транслокази.

Зрозуміло, що накопичення такої надспіралізації (еластичної напруги) не може продовжуватись нескінченно: врешті решт напруга буде блокувати процес транслокації. Отже, має бути спосіб розв’язувати цю проблему − знімати надспіралізацію, релаксуючи ДНК.

Інструментом, який використовується для цього, є спеціальні ферменти − ДНК-топоізомерази (topoisomerases). Оскільки зміна кількості зчеплень є можливою лише за умови порушення цілісності полінуклеотидних ланцюгів, загальний механізм роботи топоізомераз полягає у внесенні розриву (при цьому один кінець ланцюга тимчасово ковалентно пришивається до залишку Tyr у активному центрі ферменту, а інший залишається вільним) і зворотному зшиванні цього розриву; зміна Lk відбувається у проміжку між цими двома подіями. Топоізомерази поділяються на два класи. Топоізомерази І (мономерні білки), які поділяються на два підкласи Іa і Іb, здійснюють одноланцюговий розріз ДНК. Топоізомерази Іа (присутні як у про- так і в еукаріотів) здатні релаксувати тільки негативно надспіралізовану ДНК. Фермент упізнає дестабілізовану ділянку подвійної спіралі (яка має бути присутньою в негативно надспіралізованій молекулі, див. вище), робить одноланцюговий розрив і протягує крізь нього інтактний ланцюг (рис. 26). У результаті число зчеплень змінюється на одиницю в напрямку зниження рівня негативної надспіралізації.

Оскільки впізнається дестабілізована ділянка, топоізомераза Іa спрацьовує тільки за наявності досить високої негативної надспіралізаціїі не здатна релаксувати ДНК повністю − знизити ΔLk до 0. Основна роль топоізомераз цього типу − підтримувати певний оптимальний рівень надспіралізації в ДНК бактеріальної клітини.

Рис. 26. Схема дії топоізомераз Іa.

Топоізомерази Іb (тільки еукаріотичні) переводять будь-яку ДНК у максимально релаксований стан. Механізм їхньої дії є дуже простим: мультидоменний мономерний білок зв’язується з ДНК, оточуючи подвійну спіраль з усіх боків (рис. 27); здійснюється одноланцюговий розрив (див. рис. 27, а); один із кінців, які утворилися, отримує змогу вільно обертатися навколо інтактного ланцюга; після трьох-чотирьох випадкових обертів розрив зшивається, і фермент дисоціює. Оскільки оберти є вільними, вони здійснюються в напрямку зниження напруги − максимальної релаксації. Зрозуміло, що Lk в результаті роботи топоізомерази змінюється на величину, кратну одиниці, − на кількість обертів.

Таким чином, топоізомерази І обох типів змінюють число зчеплень шляхом зміни твіста подвійної спіралі. Іншою спільною ознакою топоізомераз І є незалежність їхньої активності від АТР: відновлення цілісності полінуклеотидного ланцюга відбувається після тимчасового ковалентного пришивання одного з кінців до активного центру ферменту й не потребує зовнішніх джерел вільної енергії.

Рис. 27. Еукаріотична топоізомераза І у комплексі з ДНК у двох проекціях (1K4S).

Топоізомерази ІІ, на відміну від топоізомераз першого класу, змінюють число зчеплень шляхом зміни райзингу циркулярної ДНК.

Є й дві інші відмінності: ці субодиничні білки мають два активні центри, в яких відбувається розрізання обох полінуклеотидних ланцюгів; фермент є активним тільки у присутності АТР, гідроліз якої використовується для здійснення конформаційних змін білка. Структурні домени двох субодиниць еукаріотичної топоізомерази ІІ (рис. 28) або чотири субодиниці прокаріотичних топоізомераз цього типу утворюють своєрідні верхні та нижні «ворота», які здатні розкриватися та закриватися при структурних перебудовах.

Схему роботи топоізомерази ІІ зображено на рис. 29: 1) ділянка ДНК, яка називається G-сегментом, зв’язується з ферментом, що викликає спорідненість ферменту до АТР; 2) у відповідь на зв’язування АТР відбувається конформаційна зміна, яка супроводжується замиканням іншої зв’язаної ділянки ДНК – Т-сегмента, і дволанцюговим розривом у складі G-сегмента; 3) відбувається гідроліз АТР, що приводить до проштовхування Т-сегмента крізь розрив; 4) здійснюється зшивання розриву та звільнення обох сегментів. Шляхом описаної операції можна перетворити, наприклад, одну надспіралізовану молекулу на рис. 24 в іншу, звідки зрозуміло, що число зчеплень при роботі топоізомераз ІІ змінюється на величину, кратну двом.

Рис. 28. Еукаріотична топоізомераза ІІ (1BJT).

Рис. 29. Схема дії топоізомерази ІІ.

Напрямок зміни Lk залежить від взаємної орієнтації G- і Т-сегментів. Еукаріотичні топоізомерази ІІ дозволяють обидві орієнтації: у результаті Lk змінюється в напрямку релаксації ДНК. Але до класу топоізомераз ІІ належить також бактеріальний фермент – гіраза (gyrase), який допускає тільки одну орієнтацію – її зображено на рис. 29. Результатом роботи гірази є зміна Lk тільки в одному напрямку – накопичення негативної надспіралізації. Це має важливі функціональні наслідки, оскільки сприяє дестабілізації подвійної спіралі ДНК на певних важливих ділянках.