Типы световых микроскопов

Классификация микроскопов связана с классификацией объекта, способом его освещения, а также, с принципом построения изображения и требованиями комфортности наблюдений.

Первый признак разделения связан с объектом исследования. По этому признаку микроскопы можно разделить на следующие основные виды.

Микроскопы плоского поля -это микроскопы, оптическая схема которых обеспечивает воспроизведение объекта в двухмерном пространстве - двухмерное изображение. Объекты исследования тонкие, в среднем, толщиной от 10 мм до 0,1 мм, просматриваемый слой от 1 мм до 0,001 мм. В этих микроскопах возможно наблюдение объемного изображения в пределах 100-200 мкм по высоте за счет особых способов освещения (эффекты косого освещения, фазового контраста, дифференциально-интерференционного контраста);

Стереоскопические микроскопы - это микроскопы, оптическая схема которых обеспечивает воспроизведение объекта в трехмерном пространстве - объемное, трехмерное изображение. Объекты исследования габаритные, в среднем толщиной от 100мм до 1мм, просматриваемый слой по высоте/глубине от 50 мм до 0,5 мм. В этих микроскопах можно наблюдать и плоские объекты.

Имеются две схемы построения стереоскопических микроскопов:

1. по Грену - это схема, при которой объект наблюдается под разными углами с помощью двух монокулярных микроскопов наклоненных под углом 12°-17° друг к другу. Расположенные под углом друг к другу, они в совокупности составляют единый сдвоенный апертурный угол. Иными словами, внешние образующие апертурного конуса каждого объектива составляют единый апертурный угол, который и участвует, согласно волновой теории образования изображения, в создании единого изображения объекта. Внутренние образующие апертурного угла при этом перекрываются.

После прохождения света через объектив монокулярного микроскопа идет обычное построение увеличенного изображения. Для каждого из двух микроскопов - свое изображение, но общими являются:

входной апертурный угол ;

единое поле;

одинаковое увеличение.

Каждый монокулярный микроскоп строит двухмерное изображение объекта. Как же получается трехмерное, объемное изображение? Третья составляющая формируется за счет той области резкого видения, которая образуется в пределах пересечения глубин резкости одного и другого объективов, расположенных под углом друг к другу. Все это формирует в нашем сознании увеличенное трехмерное изображение объекта.

Эта схема, известна как схема Грену, была создана первой и до сих пор пользуется популярностью там, где необходимо хорошее качество изображения и высокое разрешение при небольшом поле на предмете.

2. Стереомикроскоп по схеме Аббе

Существует еще одна схема создания микроскопа со стереоскопическим эффектом — схема Аббе. Ее основу составляет один основной объектив.

Схема Аббе реализуется с помощью объектива большого диаметра, далее идет разделение на два канала со стереобазой, обеспечивающей наклон основной оси апертурного пучка каждого канала под углом 12°—17, в каждую ветвь входит линзовая система (система Галилея), обеспечивающая дополнительно сменные увеличения

В построении изображения участвует свет, прошедший через объект (или отразившийся от него) и полностью заполнивший входную апертуру объектива. А вот при выходе из объектива сразу происходит разделение светового потока по двум параллельно расположенным каналам. Таким образом, входная апертура объектива одна, а выходная разделена на две равные.

Если пойти обратным ходом, то оптическая ось (центр оптической системы) каждого канала пройдет через свой участок основного объектива и будет являться образующей конуса, угол которого составляет 1/2 от апертуры основного объектива. Таким образом в нашем сознании в построении увеличенного изображения объекта принимают участие два разных микроскопа - правый и левый.

В той и другой схеме обязательным условием является наличие или двух микроскопов, или двух оптических каналов, расположенных под определенным углом друг к другу. Естественно, что при этом визуальная насадка всегда должна быть бинокулярной.

Обе схемы реализуют основные принципы получения трехмерного изображения:

раздельное наблюдение объекта под определенным углом;

получение правильного стереоскопическоговосприятия наблюдаемого пространства за счетпрямого изображения предмета, которое обеспечивается оборачивающей призменной илилинзовой системами;

обеспечение углового стереоскопического параллакса за счет устройств раздвижки по глазной базе наблюдателя обычно с помощью призменных систем и шарнирных механизмов раздвижки по базе.

Для удобства работы с объектами или в зависимости от условия их размещения (специальная посуда, термокамера) микроскопы конструктивно могут быть выполнены в двух вариантах:

Прямые микроскопы (классическое построение схемы микроскопа) сконструированы таким образом, что наблюдательная часть микроскопа (бинокулярная насадка с окулярами) расположена сверху объекта. Это относится как к микроскопам плоского поля, так и к стереомикроскопам.

Инвертированные микроскопы(перевернутое построение схемы микроскопа) сконструированы таким образом, что наблюдательная часть микроскопа (бинокулярная насадка с окулярами) расположена снизу объекта. Этот конструктивный признак относится только к микроскопам плоского поля.

Второй признак связан с построением осветительной системы микроскопа.

В зависимости от способа освещения все рассмотренные выше типы микроскопов можно разделить следующим образом.

Микроскопы проходящего света(классические микроскопы для биолого-медицинских исследований), основной принцип освещения, в которых связан с тем, что свет проходит через объект.

Собственно микроскопы отраженного света,в которых свет проходит через оптическую систему микроскопа (в том числе и объектив как часть осветительной системы), отражается от объекта и вновь проходит через оптическую систему микроскопа (объектив как основной элемент, воспроизводящий увеличенное изображение объекта);

Микроскопы падающего света, в которых свет "падает" на объект, минуя оптическую систему микроскопа, отражается от объекта и проходит через оптическую систему микроскопа (объектив). В основном микроскопы падающего света — это стереоскопические микроскопы.

Обе основные осветительные системы могут быть конструктивно объединены, тогда микроскоп становится микроскопом проходящего и отраженного света. Обычно это исследовательские или универсальные микроскопы.

третий признак относится к различным принципам построения изображения. В основном это связано с физико-химическими явлениями, которые возникают при воздействии светового потока на объект или препарат, приготовленный специальным способом. При этом световой поток также может быть подвержен изменению как по форме, так и по своим физическим свойствам.

Микроскопические биологические объекты можно разделить на амплитудные и фазовые (см. способы визуализации).

К первым (амплитудным) относятся поглощающие свет окрашенные препараты (ткани, клетки, микробы), которые можно наблюдать с помощью обычной световой микроскопии. При прохождении света через окрашенные участки препарата амплитуда световой волны уменьшается и эти участки видны как более темные, по сравнению с соседними неокрашенными участками.

Ко вторым (фазовым) - такие же, но неокрашенные, не поглощающие света объекты, структуры которых различаются по показателю преломления, а сами объекты отличаются от окружающей среды толщиной и показателем преломления. После прохождения света через эти объекты, амплитуда световой волны не изменяется, а изменяется фаза. Наш глаз различает изменения амплитуды световой волны (различие в поглощении света), но не различает изменений фазы световой волны (различий в преломлении света). Поэтому для наблюдения в микроскопе этих объектов, Цернике предложил способ перевода фазовых различий в амплитудные. Этот способ в микроскопии называется фазово-контрастным и широко используется в настоящее время для наблюдения живых, неокрашенных биологических объектов.

Объекты сильно рассеивающие свет можно наблюдать с помощью темнопольной микроскопии.

В таком случае микроскопы можно разделить следующим образом.

Микроскоп светлого поля, в котором наблюдается на светлом фоне более темное изображение объекта.

Основные условия освещения: это обычный прямо проходящий свет, изменения в котором могут быть связаны только с длиной волны светового потока, определяемой применением в осветительной системе широкополосных светофильтров из обычного цветного стекла. Редко используются узкополосные специальные светофильтры (интерференционные).

Классическая схема подобного микроскопа делает его базовым для обеспечения условий получения различных методов контрастирования.

Еще лет 30 тому назад (в 70-е годы) можно было увидеть целую гамму специальных микроскопов, которая выглядела следующим образом.

Микроскопы с методом косого освещенияобеспечивают следующую картину — на сером фоне можно наблюдать контрастное изображение объекта с неровным по толщине контуром.

Основные условия освещения: обычный прямо проходящий свет частично перекрывается до того, как попадает на объект.

Микроскопы с методом темного поля гарантируют такое изображение - на темном фоне можно наблюдать более светлое изображение объекта или ярко блестящий контур объекта.

Основные условия освещения а) в микроскопах проходящего света обычный прямо проходящий свет полностью перекрывается до того, как попадает на объект; б) в микроскопах отраженного света обычный свет, проходя через кольцевую диафрагму с непрозрачным диском, по размеру перекрывающим выходной зрачок объектива.

Микроскопы с методом фазового контраста(самый популярный микроскоп для биолого-медицинских исследований прозрачных слабоконтрастных объектов) дают возможность с максимальной степенью визуализации и детальности наблюдать на сером фоне более темное "объемное" изображение объекта, окруженное по контуру светлой полосой; при негативном (темнопольном) фазовом контрасте картина обратная.

Однако для практической работы не всегда требуются такие узкоспециализированные микроскопы. Тем более что реализация указанных методов контрастирования изображения объекта реализуется достаточно просто и практически только в пределах изменений в одном узле - конденсоре. Проще выпускать один конкретный съемный узел или дополнительное устройство (если изменения касаются еще, например, и объективов, как в фазовом контрасте).

Проблемы стали решаться еще проще, когда появился новый принцип конструирования микроскопов - модульный, который обеспечивает полную взаимозаменяемость узлов. Применение различных модулей для методов контрастирования расширяют функциональные возможности базовой модели проходящего или отраженного света, позволяя создавать именно ту модель, которая наилучшим способом удовлетворяет требованиям пользователя.

И все же в парке микроскопов есть место для специализированных микроскопов, которые, несмотря на модульность конструкций, все же имеют собственное название и определяют свою группу. Методы исследования в этих микроскопах реализуются значительно большим количеством узлов и деталей (кроме объективов и конденсоров).

Поляризационные микроскопыв общем случае обеспечивают наблюдение на сером или темном фоне разноцветного, четкого или контрастного изображения.

Основные условия освещения: обычный прямо проходящий свет с помощью поляризатора в осветительной системе превращается в линейно-поляризованный свет, а затем с помощью анализатора происходит выделение из структуры изображения тех элементов, которые связаны с анизотропией объекта.

Микроскопы этого типа имеют вариант, который в последнее время формируется на базе микроскопа светлого поля:

Микроскопы дифференциально-интерференционного контраста или интерференционного контраста, обеспечивающие наблюдение на однотонном цветном фоне яркого цветного "объемного" изображения или изображения того же цвета, что и фон, но с окантовкой из другого цвета.

Основные условия освещения: обычный прямо проходящий свет с помощью поляризатора в осветительной системе превращается в линейно-поляризованный свет, а затем с помощью специальной призмы (или другого специального элемента) и анализатора происходит создание объемного (в пределах глубины резкости объектива) цветного контрастного изображения независимо от того, является ли объект анизотропным или нет.

Эта группа микроскопов существует как самостоятельно, так и в виде модуля (дополнительных принадлежностей - специальных призм, которые устанавливаются для объективов и конденсоров)

Люминесцентные микроскопыобеспечивают возможность наблюдения на темном фоне свечения объектов под воздействием света.

Основные условия освещения: обычный прямо проходящий свет определенной длины волны попадает на объект, после чего изображение объекта строится в другой длине волны; выделение соответствующих областей спектра происходит с помощью сложной системы блоков интерференционных светофильтров.

Ультрафиолетовые микроскопы и инфракрасные микроскопы -освещение и наблюдение изображения объекта с помощью электронно-оптических преобразователей (ЭОПов) вне видимого спектрального диапазона: до 400 нм и свыше 700 нм.

Рассмотренное разделение в одинаковой степени относится как к микроскопам плоского поля прямым иинвертированным, так и к стереомикроскопам, а также к микроскопам проходящего и отраженного света.

Классификация современных микроскопов дополнилась четвертым признаком, связанным со способом наблюдения, документирования и анализа изображения:

Обычные микроскопы,в которых изображение фиксируется и анализируется глазами человека; с помощью дополнительных съемных приспособлений возможно выводить изображение на телеэкран и монитор, на фотопленку.

Фотомикроскопы -это сложная фотосистема, она встроена в схему микроскопа (причем не одна, а две-три), работает с помощью полностью автоматизированной системы настройки, в микроскопе может быть осуществлена передача изображения на ТВ-экран и может производиться видеозапись.

Анализаторы изображения -это комплекс оборудования, в котором изображение фиксируется, передается и анализируется с помощью обычных или цифровых камер в системе компьютера, обрабатывающего изображение по определенной программе.

Микроскопы проекционные,в которых проекция изображения осуществляется непосредственно на специальный большой экран (система обычного наблюдения с помощью окуляров отсутствует), при этом разработки конструкций и технологий изготовления экрана направлены на получение такого разрешения элементов изображения объекта, которое было бы приближено к разрешению обычного микроскопа.

Микроскопы сравнения,оптические системы, в которых обеспечивают объединение в одном поле видения двух изображений, полученных с помощью двух разных микроскопов, при этом два изображения могут накладываться друг на друга или располагаться рядом, занимая какую-либо часть поля.

Микроскопы-спектрофотометры,в которых производится измерение оптической плотности, светопропусканияили светоотражения участка объекта в спектральном диапазоне обычно от 300 нм до 700 нм. Это происходит с помощью фотометрических насадок, включающих ФЭУ (фотоэлектрические умножители) и системы диафрагм, ограничивающих фотометрируемый (изучаемый) участок на объекте, а также специального монохроматора, выделяющего необходимую длину волны.

Развитие современной науки, техники и технологии ведет к усовершенствованию световых микроскопов, приближая их по разрешению и созданию изображения к электронным микроскопам. Все чаще встречаются такие словосочетания: лазерный сканирующий микроскоп и конфокальный микроскоп.В них используется принцип послойного сканирования изображения с различным шагом по глубине и площади с помощью лазерного луча или обычного пучка света минимального (точечного) размера. Изображение фиксируется послойно, создавая объемное изображение объекта как бы в разрезе. Шаг сканирования объекта по глубине может составлять доли микрона: чем он меньше, тем точнее воспроизводится объемный рельеф объекта. Механо-оптическая конструкция и электронная схема микроскопов, формирующая сканирующий пучок, достаточно сложные и точные в изготовлении.

Классификация микроскопов была бы неполной, если бы мы забыли об экономическом аспекте. Естественно, что микроскопы, как любой наукоемкий прибор, имеют свой класс точности, который связан с уровнем сложности конструкции, качеством изображения и управления микроскопом, что в свою очередь оказывает влияние на серийность и цену.

Микроскопы могут быть разделены на следующие группы по классам сложности в зависимости от функции:

Микроскопы-игрушки

Основная функция, которую должны выполнять микроскопы этой группы, просто занять ребенка, правда, в эти микроскопы с большим удовольствием "играют" и взрослые. В этих микроскопах интересно то, что:

· они легкие, миниатюрное повторение настоящих микроскопов;

· качество изображения в них порой на уровне обычных;

· конструктивно и функционально микроскопы могут быть выполнены значительно "интереснее": плавное изменение окулярного увеличения, проекция изображения на малогабаритный экран, закрепленный на микроскопе, или на стену;

· массовое производство и очень низкие цены подобных микроскопов диктуют простоту конструкции;

Но в таких микроскопах не соблюдаются требования международных технических стандартов; часто оптика и механика выполняются из пластмассы и металлизированной пластмассы; микроскопы рассчитаны на минимальный срок службы (примерно на 1 год). Микроскопы-игрушки имитируют микроскопы светлого поля проходящего и падающего света, могут быть плоского поля, за рубежом встречаются стереомикроскопы.