Молекулярно-генетический метод

Молекулярно-генетический метод – выявление изменений в определенных участках ДНК, гена или хромосомы. В его основе лежат современные методики работы с ДНК или РНК, В 70-80 гг. в связи с прогрессом в молекулярной генетике и успехами в изучении генома человека молекулярно- генетический подход нашел широкое применение,

Начальным этапом молекулярно-генетического анализа является получение образцов ДНК или РНК. Для этого используют геномную ДНК (вся ДНК клетки) или отдельные ее фрагменты. В последнем ее случае, чтобы получить достаточное количество таких фрагментов, необходимо, амплифицировать (размножить) их. Для этого пользуются полимеразной цепной реакцией – быстрым методом ферментативной репликации определенного фрагмента ДНК. С его помощью можно амплифицировать любой участок ДНК, расположенный между двумя известными последовательностями.

Анализировать огромные молекулы ДНК в том виде, в котором они существуют в клетке, невозможно. Поэтому прежде их необходимо разделить на части, обработать разнообразными рестриктазами – бактериальными эндонуклеазами. Эти ферменты способны разрезать двойную спираль ДНК, причем места разреза строго специфичны для данного образца. Расщепление ДНК рестриктазами дает характерный набор фрагментов (4-6 пар оснований), отличающихся по длинне.

Фракционирование фрагментов ДНК по размеру и длине проводится с помощью электрофореза на поверхности агарозного или акриламидного геля. Под действием электрического поля фрагменты ДНК начинают перемещаться вниз по гелю со скоростью, зависящей от их длины. В результате каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля. Длину каждого фрагмента можно определить путем сравнения расстояния, пройденного им и стандартным отрезком ДНК.

Молекулярно-генетическую диагностику наследственных болезней используют и для изучения генома человека. Чтобы выявить необходимые для этого специфические фрагменты ДНК, используют блот-гибридизацию по Саузерну. Сущность этой методики состоит в следующем: сначала осуществляют денатурацию ДНК с образованием одно-цепочечных фрагментов, которые переносят на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр в буферном растворе.

Агарозный гель с фрагментами ДНК помещают на фильтровальную бумагу, смоченную концентрированным соленым раствором. На гель накладывают нитроцеллюлозный фильтр, а сверху помещают сухую фильтровальную бумагу, в которую впитывается соленый раствор. ДНК переносится вместе с раствором, но задерживается фильтром и практически полностью оказывается на его поверхности. Затем одно-цепочечные ДНК фиксируют на фильтре. Расположение фрагментов на фильтре точно соответствует их расположению в геле

Чтобы выявить нужные фрагменты проводят гибридизацию ДНК с реактивным ДНК-зондом или клонируемым фрагментом ДНК. Нуклеотидная последовательность зонда должна быть полностью или частично комплементарна изучаемому участку геномной ДНК.

Результат гибридизации комплиментарных цепей радиоактивного ДНК-зонда и фрагмента ДНК обнаруживают с помощью радиоавтографии: каждая комплиментарная зонду последовательность ДНК проявляется в виде радиоактивной полосы.

С помощью метода Саузерна можно составить рестрикционную карту генома в участке исследуемого генома и установить, несет ли данный ген какие-либо дефекты. Так, разработаны эффективные методы синтеза искусственных ДНК-зондов, которые используются в ренатальной диагностике наследственных заболеваний. Для этого из эмбриональных клеток, содержащихся в амниотической жидкости плода, выделяют ДНК и гибридизируют ее с помощью Саузерн-блотинга с радиоактивным ДНК-зондом. Аномальный эмбрион легко распознается, т.к. его ДНК будет гибридизоваться только с ДНК-зондом, комплементарным мутантной последовательности

В настоящее время имеются различные методы выявления мутаций. Их делят на прямые и косвенные. Прямая диагностика мутаций включает ряд методов:

1.Определение нуклеотидной последовательности, дающее возможность выявить замены оснований, делеции и вставки в изучаемом фрагменте.

2.выявление нарушения места рестрикции, с помощью блот - гибридизации по Саузерну. Около 50% нуклеотидных замен ведет к изменению места рестрикции. Это делает возможным выявить мутацию путем рестриктного анализа.

3.Проведение аллелоспецифической гибридизации с синтетическими зондами, что позволяет обнаружить мутации в геномной ДНК. Последовательность оснований в зонде может быть задача по дефектному или нормальному варианта гена. В обоих случаях зонд используется для гибридизации с фрагментами ДНК обследуемого индивида.

4.Химическое и ферментативное расщепление ДНК в местах неправильной сшивки оснований выявляет большую группу мутаций, ведущих к нестабильности ДНК. Метод заключается в электрофорезе двух цепочечной ДНК в нейтральном или равномерно денатурирующем гене.

5.Регистрация изменения электрофоретической молекулы ДНК.

6.Трансляция белкового продукта осуществляется в системе in vitro на основе получения специфической мРНК с добавлением лизата ретикулоцитов. Синтезируемый белок анализируют с помощью электрофореза. Изменение подвижности белка указывает на наличие мутации.

К косвенному выявлению мутаций прибегают в тех случаях, когда нуклеотидная последовательность гена еще не расшифрована, но известно ее положение на генетической карте. Технические приемы такие же, как и в прямой диагностике, но добавляется математический анализ.

9. Видимое строение хромосом человека и их морфология. Классификация и тонкая структура хромосомы

При анализе метафазных пластинок в световом микроскопе можно различить, что любая хромосома состоит из двух плеч и центромеры, или первичной перетяжки, выполняющей функцию механического центра хромосомы при делении (рисунок). Центромера является областью хромосомы, к которой при делении клет­ки прикрепляется нить веретена деления, разводящая хромосомы к полюсам клетки. Кроме первичной перетяжки некоторые хромо­сомы имеют вторичную перетяжку, не связанную с процессом прикрепления нитей веретена. Месторасположение вторичной пе­ретяжки в хромосоме связано с образованием ядрышка, а этот участок хромосомы называют ядрышковым организатором. Длин­ное плечо хромосомы обозначается латинской буквой «q», корот­кое — «р».

Концевые участки хромосом имеют сегменты, препятствующие склеиванию хромосом своими концами, и тем самым способствуют сохранению их целостности. Эти сегменты были названы теломерами.

Некоторые акроцентрические хромосомы имеют так называемые спутники — участки, соеди­ненные с остальной частью хромосомы тонкой нитью хроматина.

Рисунок - Схематиче­ское изображение хро­мосомы

Такие хромосомы называют спутничковыми. Размер спутника от­носительно длины всей хромосомы постоянен для каждой конк­ретной хромосомы. В кариотипе человека спутники имеются у пяти пар хромосом: у 13, 14, 15, 21 и 22-й.

Классификация и номенклатура равномерно окрашенных хро­мосом человека впервые были приняты на международном сове­щании в 1960 году в г. Денвере, в дальнейшем несколько изменен­ные и дополненные (1963 г., Лондон и 1966 г., Чикаго). Согласно классификации все хромосомы человека разделены на 7 групп, расположенных в порядке уменьшения их длины, и обозначаются буквами английского алфавита от А до G. Все пары хромосом ста­ли нумеровать арабскими цифрами.

Группа А (1 —3-я) – самые большие хромосомы; 1 и 3-я -метацентрические, 2-я — субметацентрическая.

Группа В (4 и 5-я) — крупные субметацентрические хромосомы.

Группа С (6— 12-я и Х-хромосома) — субметацентрические хро­мосомы среднего размера.

Группа D (13— 15-я) — акроцентрические хромосомы средних размеров.

Группа Е (16—18-я) –– маленькие субметацентрические хро­мосомы.

Группа F (19 и 20-я) – самые маленькие метацентрические хромосомы.

Группа G (21, 22-я и У) – самые маленькие акроцентрические хромосомы.

Предложенная классификация позволяла четко различать хро­мосомы, принадлежащие к различным группам (рисунки).

С 1960 г. начинается бурное развитие клинической цитогенетики: в 1959 г. Дж.Лежен открыл хромосомную природу синдрома Дауна; К. Форд, П. Джекобе и Дж. Стронг описали особенности кариотипа при синдромах Клайнфельтера и Тернера; в начале 70-х гг. была открыта хромосомная природа синдромов Эдвардса, Патау, синдрома «кошачьего крика»; описана хромосомная не­стабильность при ряде наследственных синдромов и злокачествен­ных заболеваниях.

Рисунок - Хромосомный набор мужчины

Рисунок - Хромосомный набор женщины

Вместе с тем применение метода получения равномерно окра­шенных хромосом оказалось недостаточно эффективным для иден­тификации хромосом.

В начале 70-х гг. были разработаны методы дифференциальной окраски хромосом, которые позволяли однозначно идентифици­ровать каждую хромосому. Методы были основаны на способности некоторых красителей специфически связываться с конкретными участками хромосом в зависимости от их структурно-функциональ­ной организации. Предложенные методы выявляли линейную не­однородность (сегменты) хромосом. На практике наибольшее при­менение получили методы дифференциальной окраски красителем Гимза (G-окраска) и флюоресцирующим красителем акрихи­ном или акрихинипритом (Q-окраска).

На рисунке представлены хромосомы человека при G-окраске. Хорошо видно, что каждая хромосома человека имеет только ей свойственную последовательность разношироких полос.

Это позво­ляет точно идентифицировать любую из хромосом и обнаруживать относительно крупные изменения в их структуре. При анализе метафазных хромосом средней конденсации можно четко различить около 350—400 относительно крупных сегментов на гаплоидный набор. На стадиях, предшествующих метафазе, хромосомы менее спирализованы и поэтому имеют большую поперечную подразделенность. Были разработаны методы анализа хромосом на деля­щихся клетках в стадии прометафазы. Использование этого мето­дического подхода позволило получить хромосомы с разной сте­пенью сегментации — от 800 до 2500 сегментов на гаплоидный набор.

Поперечная исчерченность, обнаруживаемая различными ме­тодами, в принципе выявляет одни и те же сегменты хромосомы и является результатом неравномерной конденсации хроматина по всей ее длине. В зависимости от степени спирализации ДНК в хро­мосоме выделяют гетерохроматиновые и эухроматиновые районы, для которых характерны различные функциональные и генетиче­ские свойства.

Гетерохроматиновый район представляет собой участок кон­денсированного хроматина (высокоспирализованная ДНК), кото­рый выявляется при дифференциальном окрашивании в виде тем­ных полос. Присутствие гетерохроматина можно обнаружить и в интерфазном ядре, где он отчетливо выявляется в виде интенсив­но окрашенных глыбок хроматина. Считывания генетической ин­формации с данных участков не происходит. Различают структур­ный и факультативный гетерохроматин. Структурный гетерохроматин постоянно присутствует в определенных регионах хромосомы. Например, он всегда обнаруживается вокруг центромер всех хро­мосом. Факультативный гетерохроматин появляется в хромосоме при сверхспирализации эухроматиновых районов. Факультативной гетерохроматизацией может быть охвачена целая хромосома. Так, в клетках женского организма одна из Х-хромосом полностью инактивирована путем гетерохроматизации уже на ранних этапах эмб­рионального развития. Ее можно обнаружить в виде глыбки гетеро­хроматина на периферии ядра. Такая инактивированная Х-хромосома называется половым хроматином, или тельцем Барра (рисунок). Благодаря гетерохроматизации Х-хромосомы в клетках женского организма происходит выравнивание количества генов, функцио­нирующих в мужском и женском организмах, поскольку у мужчин имеется только одна Х-хромосома.

Эухроматиновые регионы хромосом в интерфазном ядре не видны, поскольку представлены хроматином в деконденсированном состоянии. Это указывает на их высокую метаболическую ак­тивность. Действительно, эухроматиновые районы содержат уни­кальные гены, контролирующие синтез различных белков. При дифференциальном окрашивании метафазных хромосом они оп­ределяются как светлые полосы.