Подготовка и стерилизация питательных сред.

Основы технологии, процессы и аппараты биотехнологических производств

Любой биотехнологический процесс (лабораторный или промышленный) реализуют условно в три основных этапа. Первый из них – подготовительный (предферментация), когда необходимо выполнить все подготовительные работы (подготовка и стерилизация питательных веществ (субстрата для культивирования микроорганизмов-продуцентов), наработка (накопление) используемого продуцента, стерилизация и подготовка основного оборудования (реактора – ферментера). Второй этап – основной (ферментация)включает в себя стадию культивирования соответствующего микроорганизма-продуцента и накопления (наработки) целевого продукта. На третьем этапе – постферментационномосуществляется выделение и очистка целевого продукта.

Существует два основных подхода к интенсификации биотехнологических процессов, которые заключаются, с одной стороны, во внедрении новых высокопродуктивных биологических объектов (продуцентов), а с другой – в широком применении эффективных технологических приемов (технологических режимов), обеспечивающих максимально комфортные условия для их жизнедеятельности и накопления целевого продукта. Указанная цель достигается подбором подходящего сырья (субстрата для выращивания продуцента), разработкой наилучшей конструкции биореактора (ферментера), оптимизацией условий культивирования продуцента, обеспечением эффективного контроля за самим технологическим процессом, а, также усовершенствованием способов выделения и очистки целевого продукта.

Подготовка и стерилизация питательных сред.

В статьях расходов на производство продуктов микробного синтеза одно из первых мест занимает сырье. При производстве 1*10⁹ ЕД пенициллина, например, необходимо израсходовать примерно 6,5 кг углеводсодержащего сырья.

Для проведения ферментационных процессов, наряду с очень дорогим пищевым сырьем, таким как мука кукурузная, соевая, пшеничная, крахмал, пищевой сахар, глюкоза, лактоза, растительные масла, применяют и значительно более дешевые, являющиеся отходами пищевой промышленности - гидрол, меласса, зеленая патока, молочная сыворотка, кукурузный экстракт, рыбно-костная мука, гидролизаты кукурузных кочерыжек, соломы, подсолнечной мезги, а также специально получаемые продукты - гидролизаты древесины и торфа, парафины нефти, метан, этанол и др.

Выбор сырья определяется обычно двумя основными факторами:

1.Особенностями культивирования того или иного продуцента. Например, дрожжи прекрасно растут на питательной среде содержащей один основной компонент (углевод, углеводород, спирт) и минимальное количество ростовых факторов (витамины, микроэлементы). Культуры растительных и животных клеток, некоторые микроорганизмы требуют наличия в питательной среде десятков, а иногда и сотен компонентов, часто весьма экзотических (экстракты из эмбрионов животных, компоненты кровяной плазмы и т.д.).

2. Потребительской стоимостью и себестоимостью целевого продукта. Если

речь идет о ценном лекарственном препарате со стоимостью в десятки долларов за грамм и выше, остро необходимом, то стоимость сырья не имеет решающего значения. Если речь идет о крупнотоннажном производстве дешевых продуктов (этанол, глицерин, органические кислоты, витамины и др.), то стоимость сырья играет зачастую решающую роль в рентабельность того или иного производства. Так в начале 50-ых годов ХХ века во всех странах были закрыты предприятия по микробиологическому производству глицерина, ацетона и бутанола т.к. они не смогли конкурировать с производством аналогичных продуктов из нефтяного сырья химическим путем. Единственной страной, где эти производства функционировали до конца 80-ых годов ХХ века была ЮАР, которая имела высокоразвитое сельское хозяйство, но не имела собственных месторождений нефти и не могла покупать нефть на мировом рынке из-за режима санкций, которые были наложены на нее по решению ООН.

Растительная биомасса представляет собой достаточно хорошо утилизируемые источники углерода для биотехнологических целей. На основе этих источников основано давно существующее производство алкоголя из зерна и крахмалсодержащих корнеплодов. Растительные источники могут рассматриваться как практически неистощимые. Первичная продукция фотосинтеза (рост растений за счет использования солнечной энергии) на земле обеспечивает 2×1011 т вещества (биомассы) в год в пересчете на сухой вес! Наибольшая доля биомассы (около 44 %) образуется в виде древесины. Вызывает удивление факт, что продукция сельского хозяйства составляет лишь 6 % первичной продукции за счет фотосинтеза, хотя именно из этого количества получается основная часть пищи для людей и животных, а также многие необходимые материалы (например, для текстильной и бумажной промышленности).

Наиболее подходящим и доступным, чтобы служить питательным субстратом для биотехнологических процессов, является сырье, используемое в производстве сахара – сахарная свекла и сахарный тростник. Однако в настоящее время в мире традиционное использование сахара постепенно снижается, и он заменяется более эффективными подсластителями. Складывающаяся ситуация на мировом сахарном рынке будет способствовать поискам его нового применения, так как многие страны тропических областей испытают существенные экономические трудности, если исчезнет сахарный рынок. Уже сейчас сахарный тростник используется в качестве субстрата для бразильской «топливной» программы (производство этанола как горючего для двигателей внутреннего сгорания и в первую очередь для автомобилей, поскольку они меньше загрязняют атмосферу). Бразильский пример быстро убеждает многие другие страны в перспективности такой новой технологии.

Существенную значимость представляют крахмалосодержащие сельскохозяйственные продукты, включающие различные злаки, такие, как кукуруза, рис, пшеница, картофель, различные корнеплоды, сладкий картофель и маниока. Некоторым недостатком крахмала является то, что до использования в качестве питательного субстрата он обычно должен быть разрушен до моносахаридов или олигосахаридов путем ферментативного или химического гидролиза. Тем не менее, в настоящее время с определенным успехом разрабатываются перспективные биотехнологические процессы, основанные на использовании данного полисахарида.

Половину сухой растительной биомассы как сельскохозяйственного, так и «лесного» происхождения составляет один из самых распространенных биополимеров – полисахарид целлюлоза, являющийся ценным источником энергии и углерода. Почти не вызывает ни у кого сомнения, что целлюлоза должна рассматриваться в качестве основного питательного сырья для биотехнологических процессов. Однако необходимым условием подготовки данного материала к использованию в качестве биотехнологического сырья является ее гидролиз до простых водорастворимых сахаров (глюкозы, целлобиозы). Как ни странно, но это до сих пор представляет довольно трудную задачу.

Дело в том, что сама чистая целлюлоза может быть довольно легко разрушена путем химического или ферментативного гидролиза до растворимых сахаров, которые затем легко подвергаются ферментации (сбраживанию) микроорганизмами с образованием этанола, бутанола, ацетона, одноклеточного белка (SCP), метана и многих других продуктов. За год в процессе фотосинтеза на Земле образуется 22 миллиарда тонн целлюлозы, или 24 тонны на человека. Таким образом, целлюлоза может служить неисчерпаемым источником технической глюкозы. Однако практически во всех растениях целлюлоза находится в виде комплекса с гемицеллюлозой и лигнином, что и обеспечивает твердость древесины. Если гемицеллюлоза, состоящая в основном из моносахарида ксилозы с примесью арабинозы и глюкоуроновой кислоты легко подвергается гидролизу и то же может служить источником моносахаридов (отходы целлюлозно-бумажной промышленности), то лигнин, представляющий собой биополимер нерегулярного, трудно определяемого состава, состоящий из молекул многоосновных фенолов с неорганическими включениями, практически не подвержен гидролизу в тех же условиях. Смолообразные продукты, содержащие лигнин и продукты его частичного разложения, загрязняют аппаратуру, забивают трубопроводы, обволакивая частицы целлюлозы тормозят их гидролиз, отравляют растворы моносахаридов. Проблемой очистки от лигнина и его переработки ученые разных стран занимаются уже более ста лет, однако проблема по-прежнему далека от решения. Поэтому растворы моносахаридов, получаемые гидролизом целлюлозосодержащего растительного сырья, даже после сложной, многоступенчатой очистки используют обычно для получения непищевых, технических продуктов (этиловый спирт”гидролизный”-“гидрашка”, кормовые дрожжи, органические кислоты).

Другим доступным источником углерода и энергии являются некоторые компоненты нефти и газа. Наилучшим субстратом из компонентов нефти являются н-алканы или парафины (особенно жидкие) с числом углеродных атомов от 10 до 20.. Их могут утилизировать большинство бактерий и дрожжи. Эти соединения являются компонентами фракции дизельного топлива (солярки), получаемой при перегонке нефти. Поскольку н-алканы имеют высокую температуру замерзания, то их присутствие в дизтопливе нежелательно, и для получения топлива высокого качества проводят процесс депарафинизации. Одним из направлений утилизации получаемых н-парафинов может быть использование их в качестве субстрата для микробиологических производств. В 60-80-е годы в странах Запада и в СССР были построены крупнотоннажные производства кормовых дрожжей (белково-витаминных концентратов – БВК). В частности такое производство было организовано на базе Кстовского нефтеперегонного завода. Однако резкое повышение цен на нефть и экологическая опасность (дрожжевой белок оказался сильным аллергеном для человека), привело к повсеместному закрытию этих производств. Имеются производства лимонной и кетоглутаровой кислоты на базе н-алканов.

Другими перспективными источниками углеводородсодержащего сырья могут служить синтетический этанол, получаемый каталитической гидратацией этилена (категорически запрещен для использования в пищевых продуктах и лекарствах), синтетический метанол, а так же природный газ, очищенный от органических соединений серы (сульфидов, меркаптанов).

Однако и нефть, и газ должны рано или поздно истощится. Поэтому биотехнологии ориентируются на возобновляемые источники сырья. Помимо растительной биомассы другим неисчерпаемым источником дешевого сырья для биотехнологических производств могут служить различные отходы сельского хозяйства (отруби, шелуха семян, жмыхи, кочерыжки, кукурузные початки и др.), пищевой промышленности (меласса-маточник после кристаллизации упаренного раствора сахара, молочная сыворотка), целлюлозно-бумажного производства (варочные щелока, получаемые при термической обработке древесины слабыми растворами сернистой и серной кислот). Даже некоторые отходы одних биотехнологических производств могут служить прекрасным сырьем для других. Так спиртовая барда, остающаяся после отгонки спирта из бражки используется для микробиологического производства некоторых витаминов (В₁₂).

Приготовление питательных сред для ферментационных процессов обычно рассматривается как мало интересная часть общей задачи, но фактически оно является краеугольным камнем, обеспечивающим успех всех последующих этапов. Среды неподходящего состава обусловят низкий уровень ростовых процессов и, следовательно, низкий уровень выхода целевого продукта. Поэтому рассмотрим основные моменты, связанные с этим процессом.

Жидкие компоненты питательных сред (кукурузный экстракт, патоку, мелассу, гидрол, растительные масла, рыбий жир) доставляют на производство в железнодорожных цистернах и хранят в специальных сборниках на складах заводов и транспортируют по коммуникациям с помощью вакуума, сжатого воздуха или перекачивают насосами. Дозировку жидких компонентов осуществляют по массе или по объему в соответствии с прописью среды и контрольными показателями каждой партии этого нестандартного вида сырья.

Сыпучие компоненты сред из транспортной тары забирают или в специальные бункеры или хранят на складах в исходной упаковке. Для транспортировки сыпучих компонентов используют ленточные и винтовые конвейеры, элеваторы, пневматический транспорт.

Жидкие питательные среды приготовляют в аппаратах-смесителях с мешалкой, куда загружают отдельные компоненты в опре­деленной последо-вательности, установленной по регламенту.

Приготовление сложных комплексных сред, в состав которых, кроме минеральных компонентов и сахаров, входит мука, крахмал, кукурузный экстракт, проводят в нескольких смесителях. Куку­рузный экстракт обычно кипятят с мелом для нейтрализации содержащихся в нем аминокислот и органических кислот. Муку, крахмал предварительно заваривают и тщательно перемешивают, чтобы не допустить образования крупных комков, которые могут быть причиной нестерильных операций, поэтому реакторы должны быть снабжены барботерами для подачи пара.

Часто для снижения вязкости питательной среды, содержащей достаточно большую концентрацию кукурузной муки или крахмала проводят их частичный гидролиз амилолитическим ферментом - оризином (продуцент - Aspergillus oryzae) с последующей его инактивавацией нагреванием.

В связи с тем, что в большинстве своем питательные среды имеют жидкую и твердую фазы, возникает необходимость тонкого измельчения твердых компонентов - отрубей, муки грубого помола, рыбно-костной муки, соевого жмыха. В этих целях с большой эффективностью используют роторно-пульсационный аппарат, через который пропускают суспензию компонента перед завариванием или после него. Благодаря этой процедуре не только избавляются от комков, образовавшихся при заваривании, но и повышают степень использования сырья, равно как и получают возможность применять отдельные виды сырья (например, среды рыбно-костной мукой, плохо поддающиеся стерилизации из-за

большого количества рыбьих глаз).

Растворы сахаров, нуждающиеся в более щадящих режимах стерилизации, рекомендуют готовить и стерилизовать отдельно, смешивая с основной средой только в ферментаторе.

Некоторые виды сырья, например, соевая мука, вызывают повышенное вспенивание среды, поэтому для снижения пенообразования при стерилизации в такие среды добавляют жир в качестве пеногасителя. Подобная мера вызвана технологической необходимостью, в принципе, добавление жира в среду повышает (устойчивость спор к тепловому воздействию и поэтому крайне нежелательно. Все жировые компоненты сред необходимо стерилизовать отдельно. Для этого, как правило, предварительно готовят водно-масляную или водно-жировую эмульсию с хозяйственным мылом, повышающим ее стойкость.

Качество используемой воды зависит от назначения питательной среды. Чаще всего применяют артезианскую, реже - водо­проводную воду. В крупнотоннажных производствах кормовых дрожжей и белкововитаминных концентратов (БВК) используют воду, полученную по замкнутому циклу этого производства, то есть прошедшую очистные сооружения. В производстве кровезамени­телей используют только апирогенную воду (бидистиллят).

Под стерилизацией сред обычно понимают любой метод воз­действия, обеспечивающий удаление из них микробов - контаминантов или разрушение (гибель) последних. Наиболее распространенным и универсальным среди возможных методов, вызывающих деструкцию микроорганизмов, является метод, основанный в использовании высоких температур. Клетки микроорганизмов, а так же их споры более чувствительны к тепловому воздействию, чем большинство химических веществ, используемых в питательных средах. На практике главная цель стерилизации - достижение стерильности, при сохранении качества питательной среды. Длительность экспозиции, или время выдержки - это тот временной интервал, в пределах которого погибают микроорганизмы, но сохраняется качество питательной среды..

Тепловую стерилизацию сред (по способу ее проведения) под­разделяют на периодическую и непрерывную. При периодическом способе стерилизации процессы: нагрев, выдержка и охлаждение среды протекают последовательно во времени в одном аппарате. Это может быть ферментер, посевной аппарат или специальный стерилизатор. Весь объем среды нагре­вают в аппарате до заранее выбранной температуры, выдерживают при этой температуре строго определенное время и охлаждают водой, подаваемой в рубашку аппарата или змеевик. Сам процесс нагрева осуществляют либо путем прямого введения (инжекции) струи перегретого пара с температурой до 130⁰С в питательную среду, либо подачей пара в тепловую рубашку аппарата. Метод отли­чается простотой и надежностью, однако имеет и свои недостатки.

1. В частности, ухудшается качество питательной среды из-за дли­тельного воздействия высокой температуры, при этом происходит карамелизация сахаров (образование ангидридов сахаров), де­струкция витаминов; излишне длительный нагрев приводит не только к разрушению питательных веществ, но и к образованию в среде потенциальных ингибиторов процесса ферментации, таких как аминосахара.

2. Второй недостаток связан с тем, что повышенный расход пара происходит периодически, что обусловливает неравномерность работы котельной.

3. Если процесс стерилизации питательной среды осуществляется непосредственно в ферментере, то значительно увеличивается время простоя аппарата.

4. Получение большого количества пара является весьма затратным процессом. Одним из способов уменьшения затрат могла бы быть частичная регенерация тепла, выделяющегося при остывании простерилизованной питательной среды. Это тепло можно использовать для получения горячей воды и использовать для бытовых и технологических нужд. Однако в периодическом режиме это сделать сложно и неудобно.

5. Последний, пятый, недостаток касается трудности автомати­зации процесса периодической стерилизации по сравнению с непрерывным.

При непрерывном способе стерилизации каждый элементарный процесс - нагрев, выдержка, охлаждение осуществляется в специально предназначенных для этого апаратах: нагревателе, выдерживателе, теплообменнике, которые составляют систему аппаратов для непрерывной стерилизации - установку непрерывной стерилизации (УНС). Непрерывная стерилизация имеет следующие преимущества по сравнению с периодической:

1) при непрерывном методе стерилизации каждый элементарный объем среды (бесконечно малый объем, содержащий спору) находится при более высокой температуре более короткое время;

2) благодаря более высоким температурам стерилизации и короткой экспозиции (выдерживании) деструкция компонентов питательной cpеды минимальна;

3) процесс стерилизации всего объема питательной сред растянут во времени, этим обеспечивается более равномерная загрузка котельной;

4) процесс легко контролируем и управляем;

5) отработанное тепло выделяется постоянно и равномерно, что обеспечивает возможность его использования для получения горячей воды.

Непрерывное нагревание среды может быть осуществлено без прямого контакта с теплоносителем в трубчатом, пластинчатом или спиральном теплообменнике, который встроен в стерилизатор или стоит перед ним. Но чаще всего среда нагревается до нужной температуры в течение нескольких секунд прямым введением (инжектированием) перегретого пара (100-140⁰С), полученного в паровых контактных нагревателях.

Для стерилизации небольших объемов растворов используют фильтрование через специальные фильтры-мембраны, задерживающие бактериальные клетки, а иногда и вирусы. Обычно этот способ используют для стерилизации растворов веществ, неустойчивых к нагреванию, а так же конечных продуктов (например лекарственных веществ белковой природы).

Твердые сыпучие среды, используемые для поверхностного способа культивирования, стерилизуют паром, иногда инфракрасными и γ-лучами. Стерилизация твердых питательных сред водяным паром сопровождается, как правило, комкованием частиц среды. Поскольку компоненты твердых питательных сред (жмыхи, шелуха семян, опилки) обладают низким коэффициентом теплопроводности, то комкование препятствует нормальному течению процесса стерилизации, особенно в глубине комков. Для достижения необходимого эффекта обычно используют перегретый (острый) пар (до 140⁰ С), однако это не обеспечивает абсолютной стерильности Однако он вполне достаточен для проведения многих процессов, таких как получение ферментов или органических кислот.

Подготовка воздуха

Одной из важных задач биотехнологии является получение большого количества стерильного воздуха. В наибольших масштабах стерильный воздух применяется в процес­сах культивирования для аэрации. Его также используют для венти­ляции участков цехов так называемой стерильной зоны, где в асептических условиях проводят, например, последние стадии очистки и фасовки готового продукта. В атмосферном воздухе, наряду с инертными газами, азотом, кислородом, диоксидом углерода, со­держатся пары воды и мелкодисперсные частицы. В состав дисперсных частиц, наряду с частицами пыли, копоти, входят клетки и споры микроорганизмов как в свободном, так и в сорбированном на пылевых частицах виде.

Температура и влажность наружного воздуха, количество в нем пылинок и микроорганизмов непостоянны и зависят от времен года (микроорганизмов летом в 10 раз больше, чем зимой), погодных условий - наибольшее количество пыли и, соответствено микроорганизмов приходится на сухую ветреную погоду, геогра- фического расположения предприятия, высоты забора воздуха т. д. Особенно много микробов у поверхности земли, с высотой концентрация их убывает и становится постоянной на уровне около 30 м над землей.

Очистку воздуха можно осуществить принципиально разными методами, основаными либо на уничтожении микроорганизмов, либо на удалении их. Одним из самых эффективных способов стерилизации воздуха, является облучение ультрафиолетовыми лучами. Этот метод используется для обеззараживания воздуха в боксах и технологических помещениях .

Отечественным и зарубежным опытом показано, что технически и эконо-мически оправданным в промышленности является способ очистки больших количеств воздуха на фильтрах с помощью волокнистых и пористых материалов. Таким путем удается получить воздух со степе чистоты 99,9999%. Взвешенные в воздухе частицы задерживаются волокнистым материалом благодаря инерционному и диффузионному механизмам осаждения. В общих чертах механизм инерционного осаждения основан на том, что когда воздушный начинает обтекать нить волокна на своем пути, взвешенные в этом потоке частицы движутся по инерции, отклоняются от потока воздуха и осаждаются на волокне. Эффект инерционного осаждения высок на сравнительно грубых волокнах для относительно крупных частиц и высоких скоростей воздуха. Малые частицы способны к броуновскому движению. Движущиеся вблизи волокна частицы диффундируют в случайных направлениях и могут задерживаться на поверхности волокон. Этот эффект осаждения увеличивается с уменьшением диаметра частицы, диаметра волокна и скорости воздуха.

Если очищенный воздух используют в процессе поверхностного культивирования то он должен быть дополнительно кондиционирован до необходимой температуры и влажности.