Материалы и оборудование

Чашки Петри, колбы на 250 мл, фильтровальная бумага, ножницы, скальпель, спиртовка, пинцет, предметные стекла, микробиологическая петля, стеклянная палочка с оттянутым концом, часовое стекло, пробирка со стерильной дистиллированной водой, колба с жидкой средой Гетчинсона, колба с агаризованной средой Гетчинсона, среда Имшенецкого, исследуемая почва, навоз, водные растворы фуксина и генцианвиолета, микроскоп.

Ход работы

Выделение анаэробных клетчаткоразрушающих бактерий. Для получения накопительной культуры анаэробных клетчаткоразрушающих бактерий используют питательную среду Имшенецкого. Состав среды (г/л дистиллированной воды):

NaNН₄НР0₄—1,0

КН₂РО₄ —0,5

К₂НРО₄—0,5

МgSO₄—0,4

NaСl—0,1

МnSO₄.—1 капля 1%-ного раствора

FеSO₄—1 капля 1%-ного раствора

Пептон—5,0

СаСО₃—2,0

фильтровальная бумага—15,0

рН среды—7,0—7,4

Питательную среду разливают высоким слоем в большие пробирки и в каждую пробирку нарезают 2—3 полоски фильтровальной бумаги длиной 6—8 см, шириной 0,5 см. Пробирки с питательной средой стерилизуют в автоклаве при давлении 1 атм 20 мин. Пробирки заражают комочком почвы или навоза. Часть пробирок помещают в термостат при температуре 30—35°С для выделения мезофильных форм, остальные пробирки выдерживают в термостате при 60—65°С для накопления термофильных клетчаткоразрушающих бактерий.

При 60°С через 3—4 суток в пробирках бурно начинается процесс разрушения клетчатки, жидкость пенится, выделяются газы. Полоски фильтровальной бумаги желтеют, ослизняются, постепенно превращаясь в аморфную массу, и оседают на дно. Брожение заканчивается на 8—10-е сутки. При температуре 30—35 °С клетчатка разрушается медленнее и заканчивается через 2—3 недели.

Рис. 30. Анаэробные клетчаткоразрушающие бактерии.Clostridium omelianskii. Среда Имшенецкого. Карболовый фуксин

Разрушенные массы клетчатки подвергают микроскопическому анализу. Микробиологической петлей разрушенную клетчатку переносят на предметное стекло в каплю жидкости из пробирки и делают мазок.

Мазок окрашивают фуксином или генцианвиолетом и микроскопируют, пользуясь объективом МИ-90.

В поле зрения микроскопа видны длинные палочки, спорулирующие клетки типичной плектридиальной формы и свободнолежащие споры(рис. 30).

рулирующие клетки типичной плектридиальной формы и сво-боднолежащие споры (рис. 30).

Выделение аэробных клетчаткоразрушающих бактерий. Для выделения аэробных клетчаткоразрушающих бактерий используют питательную среду Гетчинсона. Состав среды (г/л дистиллированной воды):

К₂НРО₄ —1,0

СаС1₂ —0,1

МgSО₄ —0,3

NaCl —0,1

FeCl₃ —0,01

NaNO₃ —2,5

рН среды —7,2-7,3

Питательную среду стерилизуют 20 мин в автоклаве при 1 атм. Параллельно из фильтровальной бумаги готовят складчатые фильтры и стерилизуют их в термостате или автоклаве.

Питательную среду разливают в конические колбы слоем 1,5—2,0 см, среду заражают комочком почвы и на поверхность среды опускают складчатый фильтр конусом вверх. Колбы закрывают ватными пробками и помещают в термостат при температуре 25—30°С на 10—14 суток. На границе питательной среды и воздуха создаются оптимальные условия питания и аэробного дыхания клетчаткоразрушающих бактерий. В этой зоне наиболее интенсивно идет процесс разрушения фильтровальной бумаги.

Через 8—10 суток на фильтре появляются желто-оранжевые пятна колоний клетчаткоразрушающих бактерий. Бумага фильтра ослизняется, разлагается, и фильтр постепенно оседает на дно. Из разрушенных масс клетчатки в колбе микробиологической петлей готовят мазок в капле жидкости. Мазок окрашивают фуксином или генцианвиолетом и микроскопируют, пользуясь объективом МИ-90. На препарате среди волокон клетчатки видны различные клетчаткоразрушающие бактерии, обрывки мицелия грибов, споры грибов (рис. 31).

Выделение клетчаткоразрушающих бактерий методом посева комочков почвы

Рис.31. Аэробные клетчаткоразрушающие бактерии. Среда Гетчинсона. Генциавиолет.

Относительное количество аэробных клетчаткоразрушающих бактерий в почве определяют методом посева комочков почвы на пластинки агаризованной среды Гетчинсона. Среду Гетчинсона агаризуют. добавляя к ней 2% агар-агара, и стерилизуют 20 мин. В автоклаве при 1 атм. Из фильтровальной бумаги вырезают фильтры по размеру чашек Петри и тоже отправляют на стерилизацию. Соблюдая стерильность, разогретую среду Гетчинсона разливают в чашки Петри и на поверхность среды накладывают клетчатковый фильтр. Стеклянной палочкой с оттянутым концом высевают комочки почвы на поверхность фильтра, раскладывая их параллельными рядами на расстоянии 1 см (около 50 комочков на чашку). Засеянные чашки Петри помещают в эксикатор над водой и ставят его в термостат при температуре 25—30°С.

Через 10—14 суток и более, вокруг комочков почвы развиваются колонии клетчаткоразрушающих микроорганизмов в виде желтых, зеленых, оранжевых и коричневых пятен. В районах колоний бумага фильтра разлагается, ослизняется, становясь прозрачной. По характеру роста можно дифференцировать колонии плесневых грибов, актиномицетов и бактерий. Подсчитав число комочков почвы, давших колонии, определяют относительное количество клетчаткоразрушающих бактерий в почве, выражая его в процентах к общему числу высеянных комочков почвы.

Из зон разрушенной клетчатки готовят мазки в капле воды, помещенной на предметном стекле. Микроскопирование препаратов позволяет выделить различные виды клетчаткоразрушающих микроорганизмов. Примерная таблица записи результатов опыта:

Для определения аэробных клетчаткоразрушающих бактерий методом посева комочков почвы можно использовать и пластинки кремнекислого геля. Для пропитывания гелевых пластинок рекомендуется питательная среда Виноградского (2—3 мл среды на чашку Петри). Состав среды (г/л дистиллированной воды):

КNО₃ —2,5

KH₂РО₄ —1,0

MgSO₄ —0,5

NаСI —0,5

FeSO₄ —0,01

Мn₂(SO₄)₃ —0,01

Методика посева и обработка материала те же, что и при работе с агаризованной средой Гетчинсона.

VII