Селективные и репортерные гены. Получение трансгенных растений без селективных генов

Поскольку процесс трансформации затрагивает лишь небольшое количество компетентных клеток, то для их отбора используют селективные маркерные гены, которые, как правило, присутствуют в переносимых в растительные клетки генетических конструкциях наряду с генами целевых признаков. При высеве подвергнутых трансформации клеток на питательную среду, содержащую селективный агент, способностью делиться будут обладать только те клетки, в геном которых произошла вставка рекомбинантной ДНК. В генетической инженерии растений чаще всего в качестве маркерных используют гены устойчивости к антибиотикам и гены устойчивости к гербицидам. Если целью генетической модификации является получение гербицидоустойчивых форм, то сам целевой ген может выступать в качестве селективного гена.

Из селективных генов устойчивости к антибиотикам наиболее широкое применение нашел ген npt II (синонимы neo, aphII ) из транспозона Tn5 E. coli, кодирующий фермент неомицинфосфотрансферазу II. Этот фермент катализирует присоединение к аминогликозидным антибиотикам канамицину, неомицину, гентамицину остатка фосфорной кислоты, в результате чего происходит их дезактивация. Популярность этого гена обусловлена тем, что он очень эффективен, пригоден для широкого круга видов растений и хорошо изучен. Его экспрессия в растении не влияет на экспрессию растительных генов. Многочисленные исследования, а также уже достаточно длительная история его использования показали, что продукт этого гена является безопасным для здоровья человека и состояния окружающей среды. Он присутствует в генетических конструкциях ряда трансгенных растений, официально допущенных к использованию в качестве продуктов питания и кормов. Кроме гена npt II в генно-инженерных исследованиях фигурируют также гены устойчивости к таким антибиотикам как гигромицин В, стрептомицин, хлорамфеникол и другие.

Среди генов устойчивости к гербицидам чаще всего используют ген фосфинотрицин N-ацетилтрансферазы (PAT) – фермента, дезактивирующего фосфинотрицин (глюфозинат аммония), который является активным компонентом широко применяемого во всем мире гербицида фирмы Bayer. Дезактивация гербицида происходит в результате его ацетил СoA ацетилирования с помощью РАТ. На практике нашли применение два гена, кодирующих этот фермент: ген bar устойчивости к биалофосу (биалофос содержит фосфинотрицин и два остатка L-аланина) от Streptomyces hygroscopicus и ген pat от Streptomyces viridochromogenes. Эти гены особенно эффективны применительно к злаковым растениям, поскольку канамицин для однодольных недостаточно токсичен.

Хотя, как показывает практика и результаты специальных исследований, наличие в трансгенных конструкциях селективных генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам не является опасным для здоровья человека и окружающей среды, но, учитывая озабоченность, а часто и неприятие общественностью этого факта, ученые прилагают усилия по разработке альтернативных селективных систем. В частности, предложено использовать нетоксичные источники углерода, которые не могут быть утилизированы растительными клетками, если они не имеют фермента, способного их катаболизировать. Примером таких селективных агентов являются манноза, D-ксилоза, 2-деоксиглюкоза. Имеется ряд бактериальных генов, кодирующих ферменты, необходимые для включения этих сахаров в гликолиз. Это, в частности, ген man фосфоманноза изомеразы от E. coli, ген xylA ксилоза изомеразы от Streptomyces rubiginosus или Thermoanaerobacterium thermosulfurogenes. Селективные системы на основе нетоксичных сахаров показали высокую эффективность применительно к широкому кругу видов растений. Их действие более мягкое по сравнению с антибиотиками или гербицидами, что обеспечивают более высокую частоту трансформации.

Еще один, сравнительно новый тип селективной системы основан на использовании генов, обеспечивающих ростовые преимущества или повышенную способность к морфогенезу трансформированных клеток по сравнению с нетрансформированными. В частности, для этих целей нашел применение ген ipt изопентил трансферазы из Ti-плазмиды A. tumefaciens, который кодирует биосинтез предшественника цитокинина изопентинил аденозин-5’-монофосфата. Экспрессия этого гена в трансформированных клетках повышает частоту стеблевой регенерации. При этом в связи с избыточным биосинтезом цитокининов возможны проблемы с укоренением растений-регенерантов. Для их решения предложено использовать индуцибельный промотор, позволяющий сократить время экспрессии гена ipt.

Имеется специфическая группа маркерных генов, которая широко используется в генетической инженерии растений. Речь идет о так называемых репортерных генах, которые способны менять внешний вид трансформированных клеток, благодаря чему их можно визуально отличить от нетрансформированных. Репортерные гены помещают в генетических конструкциях вслед за промотором впереди последовательности, кодирующей целевой ген. Благодаря этому по степени экспрессии репортерного гена (ее можно оценить количественно) можно судить и об экспрессии целевого гена. К репортерным генам и их продуктам предъявляют следующие требования: они не должны иметь фоновой активности (т.е. практически отсутствовать у интактных растений); не должны оказывать значительного влияния на метаболизм клетки хозяина; должны оставаться активными при значительных достройках белка; быть небольшого размера; иметь простые, чувствительные методы количественного и качественного определения белка. Репортерные гены применяют для изучения регуляторных элементов: промоторов, энхансеров, сайлэнсеров, терминальных последовательностей. В частности, при исследовании промоторов можно определить области, связанные с тканеспецифической экспрессией генов, или выделить у них светочувствительные участки и т.д.

Чаще всего в качестве репортерного гена используют ген gus (или uidA) из E. coli, кодирующий образование фермента β-глюкоронидазы. Экспрессию этого гена оценивают с помощью спектрометрических или гистохимических методов. В присутствии субстрата 4-метилумбеллиферилглюкоронида (MUG) появляется синяя окраска, интенсивность которой коррелирует со степенью экспрессии гена gus. Для выявления трансформированных клеток гистохимическими методами (они также приобретают синюю окраску) используют 5-бромо-4-хлоро-3-индолил глюкуронид (Х-gluc). У интактных (нетрансформированных) растений продукт этого гена практически не выявляется. Фермент стабилен в растительных клетках и может накапливаться в значительных количествах без какой-либо токсичности. В отсутствие субстрата фермента трансформированное растение не отличается от интактного. Сам анализ простой и высокочувствительный. Среди его недостатков – необходимость разрушения растительных тканей трансформантов для проведения исследований. Поэтому в тех случаях, когда необходимо проследить динамику экспрессии трансгена в онтогенезе растения, рекомендуют использовать такие гены, как ген люциферазы (luc) из светлячков Photinus pyralis или ген gfp зеленого флюоресцентного протеина (GFP- green fluorescent protein) из медузы Aequorea victoria.

Фермент люцифераза катализирует АТФ-зависимое оксидативное декарбоксилирование субстрата люциферина. Экспрессия гена люциферазы придает трансформированным клеткам способность к биолюминесценции. Экспрессия зеленого флюоресцентного протеина (GFP) не связана с каким-либо субстратом: флюоресценцию трансформированных клеток наблюдают в ультрафиолетовом свете, ее можно оценить количественно. GFP нетоксичен, устойчив к действию протеиназ и повышенной температуры, оказывает минимальное влияние на подвижность и локализацию гибридного белка (GFP, соединенного с целевым протеином под одним промотором).

GFP впервые был выделен и изучен О. Shimomura et al. (1962). Однако применение GFP в молекулярной биологии началось лишь в 1990-е годы после публикации работ D. Prasher по клонированию и секвенированию кодирующей последовательности этого гена. Позднее с помощью мутагенеза были значительно улучшены спектральные характеристики GFP и его физико-химические свойства (чувствительность к изменению pH, фото- и термостабильность). В частности, благодаря точковой мутации S65T (Heim et al. 1995), была усилена флюоресценция GFP, его фотостабильность, произошел сдвиг основного пика активации к 488 нм с пиком эмиссии свечения при 509 н.м., что хорошо подходило к спектральным характеристикам обычно используемых флюоресцентных фильтров и, как следствие, обеспечило возможность использования GFP практически в любой лаборатории. Были получены мутантные формы GFP, а также выделены другие флюоресцентные белки с синим, голубым, красным, оранжевым и желтым свечением. Их использование позволяет наблюдать одновременно экспрессию нескольких генов. Репортерная система на основе GFP нашла широкое применение не только в генно-инженерных исследованиях, но и других областях знаний. Первооткрыватель GFP О. Шимомура cовместно с М. Чалфи (M. Chalfie) и Р. Тсиеном (R. Tsien) были удостоены Нобелевской премии по химии за 2008 г.

С практической точки зрения маркерные гены в трансгенных растениях не выполняют какой-либо роли. Они необходимы лишь на стадии получения ГМО для отбора трансформированных клеток. Помимо проблем, связанных с негативным отношением общественности к присутствию маркерных генов у ГМО, они могут создавать определенные неудобства в работах по совершенствованию трансгенных сортов, так как при каждом последующем цикле модификации необходимо использовать новые селективные системы, тем самым расширяя круг «ненужных» растению генов. Следует также иметь в виду, что применение селективных систем, основанных на толерантности к нетоксичным сахарам, повышенной регенерационной способности трансформированных клеток, может существенно затрагивать метаболизм ГМО, что нежелательно с точки зрения биобезопасности. В связи с этим были разработаны методы получения трансгенных растений без таких генов, а также методы удаления селективных генов у трансформантов после проведения селективной процедуры.

В тех случаях, когда эффективность трансформации достаточно высока, можно использовать трансгенные конструкции, не содержащие маркерные гены. Отобрать трансгенные генотипы (фенотипы) несложно с помощью детекции целевого гена у всех полученных растений-регенерантов, или их исследования на наличие привнесенного признака. Целевой ген толерантности к гербицидам может быть использован и в качестве селективного для отбора трансформированных клеток.

Эффективным методом получения безмаркерных ГМО является котрансформация с последующим негативным отбором по селективным генам в расщепляющихся поколениях полученных трансформантов. Предложено несколько способов котрансформации. Например, целевой и селективный гены могут располагаться на разных плазмидах одного штамма агробактерии или на плазмидах разных штаммов, которыми одновременно инфицируют растительные ткани (процесс агробактериальной трансформации описан ниже в разделе 9.5). Эти гены могут быть на одной плазмиде, но на разделенных пространственно участках ее ДНК, чтобы в половых поколениях ГМО эти гены сегрегировали независимо. При высокой частоте трансформации имеется возможность отобрать трансгенные линии, несущие одновременно как селективный, так и целевой ген. Анализируя самоопыленное потомство таких ГМО или беккроссы на исходный сорт, проводят отбор генотипов, имеющих только целевой ген. Метод котрансформации имеет ряд ограничений. В частности, он может быть использован в основном к размножаемым семенами самоопылителям, представляющим собой относительно гомозиготные линии, и не пригоден для вегетативно размножаемых культур, которые по большей части гетерозиготы. Также необходимо наличие протокола трансформации культуры, обеспечивающего высокий выход трансгенных генотипов.

С целью удаления селективных генов из генома ГМО используют генетические конструкции, содержащие последовательности транспозонов. В частности, описана система с селективным маркерным геном ipt изопентил трансферазы, соединенным с транспозонным элементом Ас. Первоначально ген ipt выступает в качестве позитивного селективного агента, вызывая образование многочисленных стеблевых отростков, из которых не могут быть регенерированы нормальные трансгенные растения из-за избытка цитокининов. Однако через несколько недель культивирования с небольшой частотой появляются стебли с нормальным фенотипом. Это происходит благодаря транспозиции гена ipt иего сегрегации в соматических клетках [Ebinuma et al. 2001].

Второй подход по удалению селективных генов у ГМО основан на использовании сайт-специфических рекомбиназ. Известны рекомбиназы и последовательности ДНК, которые могут быть мишенями этих ферментов. Это, например, Cre/lox из бактериофага Р1, FLP/FRT из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, R/RS из Zygosaccharomyces rouxii. Эти последовательности размещают в генетической конструкции по краям гена, который планируется позднее удалить. Затем во втором туре трансформации вводят ген рекомбиназы. Последний ген, после того как он выполнил свою функцию, удаляют путем негативного отбора в беккроссном поколении ГМО (расщепление по этому гену и целевому гену происходит независимо). Возможен также вариант транзиентной экспрессии гена рекомбиназы. Удаление селектиного гена происходит с более низкой частотой, однако при этом ген рекомбиназы не встраивается в растительный геном и нет необходимости его затем удалять. Еще один перспективный подход – использование генетических конструкций с целевым геном, селективным геном и геном рекомбиназы на одном векторе. Ген рекомбиназы помещают под индуцибельный промотор, благодаря чему в нужный момент можно запустить процесс одновременного самоудаления гена рекомбиназы и селективного гена [Ebinuma et al. 2001].