ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ

Накопительной называют такую культуру, в которой преобладают представители одной физиологической группы или даже одного вида микроорганизмов. Метод накопительных культур был введен в практику микробиологических исследований С. Н. Виноградским и М. Бейерин­ком. Сущность его заключается в создании элективных, т. е. избира­тельных условий, которые обеспечивают преимущественное развитие желаемых микроорганизмов или группы микроорганизмов из смешан­ной популяции.

При создании элективных условий необходимо знать физиологию или четко представлять те особенности, которыми должны обладать вы­деляемые микроорганизмы. Элективные условия создают чаще всего, подбирая соответствующие среды, поскольку различные микроорганиз­мы для своего развития предъявляют неодинаковые требования к источ­никам питания. Например, микроорганизмы, способные фиксировать молекулярный азот, могут расти в среде, из состава которой исключены связанные формы азота. Если внести в такую среду почву, то из громадного разнообразия имеющихся в ней микроорганизмов в первую очередь будут развиваться азотфиксаторы. Накопительные культуры автотроф­ных микроорганизмов получают на средах, где единственным источни­ком углерода служит углекислота. Отсутствие в среде других соедине­ний углерода задерживает развитие гетеротрофов. Такие специфичес­кие питательные среды, удовлетворяющие потребности преимуществен­но одной группы микроорганизмов, носят название элективных. В за­рубежной литературе большее распространение получили термины

«накопительные» или «селективные» среды.

Накопительные культуры микроорганизмов, обладающих высокой требовательностью к составу питательных сред, получают иначе. При их выделении используется неодинаковая чувствительность клеток сме­шанной популяции к продуктам обмена веществ, накапливающимся в среде. Примером могут служить молочнокислые бактерии, для накопле­ния которых используют солодовое сусло без мела, то есть среду, первона­чальнo не обладающую элективностью. После внесения природного ма­териала, содержащего молочнокислые бактерии, в среде вначале наря­ду с молочнокислыми бактериями хорошо развиваются представители родов Enterobacter и Escherichia. Однако по мере накопления в среде молочной кислоты и этилового спирта, образуемого гетероферментативными видами, условия для развития энтеробактерий и эшерихий постепенно ухудшаются, тогда как молочнокислые бактерии, которым свойственна высокая кислото- и спиртоустойчивость, продолжают расти. Таким образом, в результате развития молочнокислых бактерий среда приобретает необходимую степень элективности, что и обеспечивает по­лучение накопительной культуры этих бактерий. Другим примером мо­гут служить уксуснокислые бактерии, которые характеризуются высо­кой устойчивостью к этиловому спирту. Накопление этих бактерий осу­ществляют на сусле, к которому добавляют 4-5% этанола.

Иногда при выделении микроорганизмов из природных популяций в среду включают антибиотики, которые отличаются специфичностью действия и позволяют избирательно подавить рост определенной группы микроорганизмов. Так, элективные условия для развития грамотрица­тельных бактерий можно создавать внесением в среду пенициллина в концентрации от 0,2 до 100 мг/л, поскольку многие виды грамположи­тельных бактерий при этом или совсем не развиваются, или развиваются медленно. Чтобы создать благоприятные условия для развития бактерий и, напротив, подавить рост мицелиальных грибов, к средам рекомендуют добавлять нистатин в концентрации от 0,1 до 20 мг/л или гризеофульвин в концентрации от 1 до 20 мг/л.

При создании элективных условий следует учитывать неодинаковое отношение различных микроорганизмов к аэрации, температуре, кислот­ности среды и так далее. Поэтому при получении накопительной культуры аэробных микроорганизмов обеспечивают большую поверхность контак­та среды с воздухом, напротив для обогащения среды анаэробными мик­роорганизмами тем или иным способом создают анаэробные условия. Культивирование при высокой температуре (50°С и выше) исключает развитие мезофильных микроорганизмов и обеспечивает рост термофилов. Селективным фактором может служить также неодинаковая ско­рость роста различных микроорганизмов при данной температуре. Например, на минеральной среде при освещении и температуре 35°С уда­ется почти полностью подавить рост зеленых водорослей и получить культуру, обогащенную цианобактериями.

При получении накопительных культур следует учитывать и такие особенности микроорганизмов, как способность к образованию эндоспор. Для накопления спорообразующих бактерий, среды инокулируют, как правило, субстратом, который предварительно пастеризуют, т. е. кратковременно прогревают при высокой температуре (10 мин при 75°С или 2-5 мин при 80 С). Таким образом, можно полностью или почти полностью исключить развитие бактерий, не образующих споры.

Следует иметь в виду, что элективные условия далеко не всегда оптимальны для роста выделяемых микроорганизмов, однако они лучше переносятся ими, чем сопутствующими формами.

О получении накопительной культуры судят по появлению xapaктерных признаков развития выделяемых микроорганизмов - помутне­ние среды, иногда сопровождаемое пигментацией, появление пленки, осадка, выделение газов. Помимо визуального наблюдения накопитель­ную культуру микроскопируют и выявляют присутствие желаемых форм. Иногда необходимо определить продукты метаболизма, образо­вание которых свойственно выделяемым микроорганизмам. Например, о развитии нитрифицирующих бактерий свидетельствует появление в среде нитрит- и нитрат-ионов и, напротив, уменьшение или даже полное исчезновение иона аммония.