Фотоэлектроколориметрия

Фотоэлектроколориметрия – определение концентрации вещества в растворе по изменению силы тока в фотоэлементе при падении на него луча света, прошедшего через исследуемый раствор (прозрачный, окрашенный). Многие соединения, слабо поглощающие в видимой области, после реакции с другими веществами дают окрашенные продукты, количество которых однозначно связано с концентрацией исходного вещества. Такую цветную реакцию используют для обнаружения этих веществ.

При некоторых стандартных условиях и определенных концентрациях вещества проводят реакцию, а затем измеряют поглощение раствора. В качестве сравнения используют ту же смесь, но без исследуемого вещества. При прохождении светового потока через окрашенную прозрачную жидкость часть света поглощается. Степень поглощения света, или коэффициент экстинкции, во многих случаях прямо пропорциональна интенсивности окраски раствора. Окраска раствора зависит от концентрации в нем растворенного вещества:чем выше концентрация, тем интенсивнее окраска и тем больше света поглощает раствор. Степень светопоглощения определяют в приборе – фотоэлектроколориметре (ФЭК) – путем уравнивания интенсивности света, прошедшего через исследуемый окрашенный раствор, и света, прошедшего через контрольный раствор. Необходимо подчеркнуть. Что на ФЭКах можно исследовать только окрашенные растворы, т.к. источником света является лампа накаливания, поэтому приборы этого класса могут работать только в видимой части электромагнитного спектра. Современные фотометры позволяют работать и в УФ-области, так как имеют два источника излучения (накаливания и ртутно-кварцевую лампы), но в отличие от спектрофотометров, вместо монохроматора в фотометрах используют набор светофильтров (светофильтр выделяет из всего спектра источника света излучение определенного диапазона длин волн).

Приготовление контрольного раствора весьма важная составляющая всех оптических методов исследования, т.к. при использовании любых оптических методов обязательно готовят контрольные растворы. В контрольный раствор добавляются все реактивы, что и в исследуемый образец, кроме определяемого вещества. При его приготовлении соблюдаются все особенности (последовательность добавления реактивов, время выдержки и т.д.), что и при приготовлении исследуемого образца. По степени светопоглощения определяют концентрацию вещества в растворе.

а) Biophotometer (Eppendorf) - компактный анализатор для определения нативной и денатурированной ДНК, РНК, олигонуклеотидов, белка по оптической плотности методами Лоури и Брандфорда, плотности суспензий бактериальных клеток. Автоматическое определение концентрации компонента в пробе; спектральный диапазон от 220 до 750 нм, фильтры 230, 260, 280, 320, 562, 595 нм; может быть укомплектован принтером.

б) Униплан(Пикон) – планшетный фотометр (используется для работы с плашками, для обработки результатов иммуноферментного анализа) два фильтра в комплекте, остальные поставляются по желанию заказчика; жидкокристаллический дисплей, работа в режиме диалога, возможность набора формулы расчета с последующим сохранением заданных параметров, запоминание калибровочной кривой.

Спектрофотометрия

Спектрофотометрия – определение количества вещества в растворе или твердой среде по измерению светопоглощения волн строго определенной длины. Светопоглощение измеряют с помощью фотоэлемента по изменению силы тока, возникающего в нем, при падении на фотоэлемент светового потока, прошедшего через контрольный, а затем через исследуемые растворы или образцы. Измерение светопоглощения производится в приборе спектрофотометре, кварцевая призма которого выявляет монохроматические пучки спектра, соответствующие максимуму поглощения исследуемого вещества. Поэтому приборы данного класса имеют больший спектр возможностей, чем фотометры. В качестве примера технических возможностей спектрофотометров приведены краткие технические характеристики СФ-56А (ЛОМО, Россия).

СФ-56А Диапазон от 190 до 1100 нм; однолучевой сканирующий; шаг сканирования 5 нм, обзорное сканирование и вывод заданных участков спектра на монитор; автоматическое однократное и многократное выполнение измерений для одного или нескольких образцов на заданных оператором длинах волн с заданным временным интервалом между циклами измерений; математическая обработка результатов измерений, вычисление оптической плотности, концентрации, а также расчет цветовых характеристик исследуемых объектов.