Изучение строения биомолекул методом хроматографии

Выяснить строение крупных молекул посредством метода дифракции рентгеновских лучей значительно легче, если известны химическая природа субъединиц молекул и хотя бы в общем виде их расположение.

Прогресс в изучении химии белка был достигнут не сразу. Ученые минувшего столетия могли только весьма голословно утверждать, что белковая молекула состоит из аминокислот. На рубеже XX в. немецкому химику
Эмилю Фишеру (1852—1919) уда­лось показать, каким образом аминокислоты ком­бинируются в молекуле белка. В 1907 г. он даже получил очень простое белковоподобное соединение, состоящее из 18 единиц: 15 молекул одной аминоки­слоты и 3 молекулы другой.

Какова же структура более сложной белковой мо­лекулы, встречающейся в природе? И в первую оче­редь, каково точное число каждого типа аминокислот в молекуле белка? Проще всего ответить на этот вопрос, расщепив белковую молекулу на отдельные аминокислоты и на основании химического анализа определив относительное количество каждого компо­нента.

Однако для современников Фишера этот путь был неприемлем. В те времена обычными химическими методами нельзя было различить аминокислоты, обла­давшие сходным строением. Ответ на этот вопрос при­шел с появлением нового метода, принцип которого в 1903 г. впервые разработал русский ботаник Миха­ил Семенович Цвет (1872—1919). Исследуя пигменты растений, Цвет получил сложную смесь, состоящую из столь сходных компонентов, что разделить ее су­ществовавшими химическими методами было почти невозможно. Тогда ученый пропустил раствор смеси по каплям через стеклянную трубку (колонку), запол­ненную порошком окиси алюминия. Поверхность ча­стиц порошка с разной силой удерживала различные вещества смеси. Когда смесь смывали свежим ра­створителем, вещества разделялись. Компоненты, на­именее прочно связанные с поверхностью порошка, смывались в первую очередь. В конце концов смесь оказывалась разделенной на отдельные пигменты, каж­дый из которых характеризовался определенной по­лосой цвета в спектре. Этот метод разделения по цве­ту получил название хроматографии (от греческих слов chromatos — окраска, цвет и graphein — записы­вать). К сожалению, работы Цвета прошли незаме­ченными. Только через полтора десятилетия Вильштеттер, вновь применив метод Цвета, добился его признания. Хроматографию стали широко применять для разделения сложных смесей.

Однако пользоваться колонкой из порошка окиси алюминия для разделения ничтожных количеств сме­си было чрезвычайно сложно. Требовался более про­стой и надежный метод.

Выход был найден лишь в 1944 г., когда англий­ские биохимики
Арчер Мартин и Ричард Синдж использовали для метода хроматогра­фии простую фильтровальную бумагу. Опыты прово­дили так. Каплю смеси аминокислот просушивали близ нижнего края полоски фильтровальной бумаги, а затем опускали его в специальный растворитель. Последний, по закону капиллярности, поднимался по полоске вверх. Проходя через высушенную каплю, растворитель увлекал за собой отдельные аминокис­лоты со скоростью, характерной для каждой конкрет­ной аминокислоты. В итоге смесь аминокислот оказы­валась разделенной. Расположение аминокислот на бумаге выявлялось окрашиванием. Определить количество аминокислоты в каждом пятне не составляло труда.

Новый метод хроматографии на бумаге оказался на редкость эффективным. Он прост и дешев, не тре­бует сложной аппаратуры, позволяет тщательно раз­делять ничтожные количества компонентов смеси. Ме­тод получил широкое применение во всех областях биохимии. Им, в частности, воспользовался Кальвин в своих экспериментах со смесью молекул из фотосинтезирующих растительных клеток. По существу, исследования без применения метода хроматографии на бумаге стали немыслимы. С его помощью появилась возможность установить точное количество различных аминокислот того или иного белка. Это в свою очередь позволило определить аминокислотный состав одного белка за другим, подобно тому как устанавливают число ато­мов различных элементов, входящих в то или иное со­единение.