Микробиологические подходы к оценке действия пестицидов

Пестициды циркулируют в биосфере уже свыше 60 лет, оказывая многообразное, часто скрытое, побочное воздействие на биоту, поэтому актуальной стала проблема разработки подходов и методов оценки степени поврежденности экосистем. Реакция отдельных элементов почвенной биоты на пестициды может иметь огромное множество разнообразных проявлений.

С точки зрения микробиолога пестициды следует рассматривать как: 1) ингибиторы отдельных ферментативных реакций; 2) ингибиторы роста целой клетки или микробной популяции; 3) субстраты первичного метаболизма, потребляемые специализированными микроорганизмами в качестве источника энергии или биогенных элементов; 4) субстраты кометаболических процессов, трансформируемые микроорганизмами в иные соединения при наличии соответствующих косубстратов; 5) индифферентные соединения, которые не влияют существенно на метаболизм микроорганизмов, по крайней мере, в тех низких концентрациях, которые обычно ожидаются при практическом использовании пестицидов в сельскохозяйственном производстве.

К общепринятым микробиологическим подходам к общему мониторингу загрязнения почв пестицидами относятся: метод посева на селективные питательные среды, индикация загрязнения с помощью чувствительных или устойчивых штаммов.

Изучение кинетики микробиологических процессов. Одним из новых подходов, позволяющих исследовать механизмы действия пестицидов на почвенную микробиоту является исследование кинетики микробиологических процессов.

Биологическая кинетика - наука о скоростях и механизмах биологических процессов, о количественных закономерностях развития биологических процессов во времени. В отличие от простых биодинамических исследований, давно и прочно утвердивших свои права в почвенной микробиологии, кинетические разработки ориентированы на познание внутренних механизмов функционирования объекта через посредство изучения его динамического поведения. Формальным признаком, отличающим кинетическое исследование от простой регистрации динамики процесса, служит применение аппарата математического моделирования, главным образом в виде систем дифференциальных уравнений. Методологический принцип расшифровки механизма при этом совпадает по своей сути с принципом любого научного исследования вообще: постулируемый механизм формулируется в виде математической модели, ставится эксперимент и производят сопоставление наблюдаемого в опыте и теоретического (ожидаемого на основании анализа математической модели) хода динамики процесса в зависимости от условий проведения эксперимента. В случае отсутствия согласия математическую модель и соответствующий механизм процесса признают неадекватным и отбрасывают. Вместо них предлагают иной механизм и строят новую математическую модель, повторяя процедуру сравнения еще и еще раз. В случае согласия считают, что постулируемый механизм и математическая модель имеют право на существование, но не более. Их не рассматривают в качестве «истины», но активно используют для дальнейшего более глубокого изучения объекта, прогнозирования динамики, а самое главное - для управления его поведением путем активного воздействия на природный объект в целях достижения наиболее рационального использования его полезных свойств. В микробиологии пестицидов многие проблемы связаны именно с кинетическими исследованиями, ибо предполагают оценку влияния пестицидов на скорость микробиологического процесса, разработку прогноза последствий возмущающих эффектов на систему, расшифровку механизма возможного побочного действия.

Согласно гипотезе о ведущей роли эндогенных ингибиторов в ограничении скорости микробиологических процессов в почве можно дать некоторую условную количественную характеристику уровня загрязнения контрольной почвы, т.е. любого почвенного образца, предыстория которого неизвестна. Для этого нужно измерить скорость микробиологического процесса, например скорость разложения вносимой в почву целлюлозы, и сравнить полученную абсолютную величину с некоторым эталонным значением. При этом необходимы строгая стандартизация условий проведения инкубационного опыта, поддержание на оптимальном постоянном уровне влажности и температуры почвы, одновременное с целлюлозой внесение в почву всех биогенных элементов, а также измерение всей кривой динамики, а не только его начальной скорости.

В относительно простых инкубационных экспериментах динамику разложения пестицидов обычно удается аппроксимировать кинетическим уравнением первого порядка:

di

= - Kt,

dt

где Kt – феноменологический параметр, формально именуемый константой первого порядка, а фактически представляющий собой величину непостоянную. Так, пестицид лонтрел разлагался в дерново-подзолистой почве (на примере АБС «Чашниково») в соответствии с данным уравнением, причем численное значение Кt оказалось равным 0,016 сут^-1. Если в почву одновременно с лонтрелом вносили крахмал, то скорость распада пестицида в несколько раз повышался, и величина Кt возрастала до 0,063 сут^-1. Затравочный эффект крахмала, вероятно, может быть объяснен кометаболическими реакциями, общим увеличением интенсивности метаболических процессов в обогащенной почве, расширением круга присутствующих в почве активных микроорганизмов и т. д.

Одной из важнейших кинетических задач при изучении превращений пестицидов в почве является раскрытие содержания феноменологического параметра Kt, установление связи кажущейся константы первого порядка с показателями жизнедеятельности почвенных микроорганизмов и условий среды. Совершенно очевидно, что динамические уравнения, описывающие детоксикацию пестицида и его возможную трансформацию в другие физиологически активные соединения, должны быть включены в целостную кинетическую модель функционирования микроорганизмов в почве.

Анализ структуры комплекса почвенных стрептомицетов. Методология изучения изменений в комплексе почвенных микроорганизмов под действием антропогенных нагрузок вообще недостаточно разработана в почвенной микробиологии. В общей экологии для решения аналогичных задач используется синэкологический подход (Одум, 1975). Перспективность этого подхода очевидна. Реакция целого более показательна, чем изменение его части. В целом (в данном случае это сообщество микроорганизмов) все части закономерно связаны друг с другом и изменение одной из них приводит к изменениям других. Одним из методов сннэкологического изучения состояния почвенной микробиоты является анализ структуры комплекса микроорганизмов, высеваемых из загрязненных образцов почвы.

Так, в полевых условиях изучали влияние на структуру комплекса почвенных стрептомицетов гербицидов: глина и тербацила (производных сульфонилмочевины). Численность почвенных актиномицетов в дерново-луговой почве увеличивалась, особенно заметные отклонения регистрировались на 30-е сутки при внесении в почву данных препаратов. Наибольшее увеличение численности наблюдалось в варианте с внесением глина в дозе 40 г/га. К 90-м суткам после внесения препаратов численность актиномицетов приближалась к контрольным значениям. Также менялся качественный состав почвенных актиномицетов рода Streptomyces. Индексы разнообразия по Шеннону заметно варьировали в зависимости от сроков и доз внесения препаратов в отличие от контрольных. На 30-е сутки во всех вариантах опыта наблюдалось увеличение индекса разнообразия по сравнению с контрольным. Это связано с возрастанием численности и частоты встречаемости Cinereus, Violaceus, Albus, Helvoloflavus Helvolus. К 90-му дню значительных отличий с контрольными вариантами не наблюдалось.

Различия в качественном составе стрептомицетов являются следствием смены видов этих микроорганизмов в почве при внесении препаратов. Одни виды стрептомицетов, доминирующие как в контроле, так и в вариантах опыта, оказались нечувствительными к действию препаратов – Cinereus achromogenes, Cinereus chromogenes, Imperfectus. Случайными или редкими во всех вариантах являлись – Cinereus chrysomallus, Albus albocoloratus, Roseus fradiae. Другие виды оказались чувствительными к внесению обоих препаратов в почву.

Метод инициированного микробного сообщества (ИМС).Сочетание синэкологического подхода с принципом ординации (Раменский, 1938) или градиентным анализом (Уиттекер, 1980) привело к созданию нового метода в фитоценологии. Этим методом изучают закономерности изменений растительного сообщества в зависимости от условий окружающей среды. Результаты выражают синэкологической диаграммой, координатными осями которой являются определенные внешние условия и количественное развитие отдельных членов сообщества. Данный прием оказался плодотворным и в экологии почвенных микроорганизмов, особенно при проведении лабораторных экспериментов, в которых изучалось влияние широкого спектра антропогенных агентов: минеральных удобрений, тяжелых металлов и других. В методе ИМС сочетаются прямые и косвенные приемы микробиологического анализа. В лабораторных константных условиях моделируется действие изучаемого фактора на активно функционирующее в почве микробное сообщество, развитие которого инициируется крахмалом. Реакция микробной системы почвы на загрязнение проявляется в изменениях организации и видового состава амилолитического микробного сообщества. Для его описания используют принцип доминирования, принятый в фитоценологии.

Данным методом было изучено действие гербицида симазина на микробную систему дерново-подзолистой почвы. Весь диапазон изменений состава и организации инициированного сообщества оказалось возможным разделить на три адаптивные зоны с различной реакцией сообщества. В зоне гомеостаза (область концентраций симазина 0-3 мг/кг почвы) не происходило существенных изменений в амилолитическом микробном сообществе. Доминировали микромицеты Mortierella ramanniana и Penicillum variabile. В зоне стресса (3-30 тыс. мг/кг) отмечены количественные изменения в составе микробного сообщества. Они выражаются в перераспределении степени доминирования микроорганизмов. Микромицеты Р. funiculosum, Р. vermiculatum и Penicillium sp., занимавшие положение редких видов в зоне гомеостаза, стали доминирующими. При этом прежние доминанты с увеличением концентрации симазина постепенно перешли в разряд редких. В зоне резистентности (30 тыс. мг/кг и выше) происходили резкие качественные изменения в составе сообщества. Преимущественное развитие получили устойчивые (резистентные) к высоким концентрациям симазина микроорганизмы: микромицеты Aspergillus sp. и Trichurus sp., и актиномицет Streptomyces sp. Аналогичные типы реакции микробной системы почвы на другие антропогенные воздействия зафиксированы ранее, что подтверждает универсальность данной модели.

Эти результаты вполне согласуются с представлениями о диагностических уровнях антропогенной нагрузки, разработанными Д. Г. Звягинцевым с соавторами (1986). Нагрузка низкого уровня не имеет последействия, и система легко возвращается в исходное состояние при элиминировании воздействия. Отрицательного влияния загрязнителя на высшие организмы, как правило, не обнаруживается. Среднему уровню загрязнения соответствуют изменения в микробной системе почвы, выражающиеся в перераспределении степени доминирования в составе активно функционирующих микроорганизмов. Эти изменения характеризуются длительной необратимостью даже после элиминирования нагрузки. Часто обнаруживается отрицательное влияние загрязнителя на высшие организмы через стимулирование развития токсинообразующих микроорганизмов. Высокому уровню загрязнения соответствуют изменения в микробной системе почвы, выражающиеся в полной смене состава активно функционирующих микроорганизмов, т. е. в образовании нового сообщества. Эти изменения еще в большей степени характеризуются необратимостью и последействием. Как правило, при таком уровне нагрузки наблюдается уже прямое отрицательное действие загрязнителя на высшие организмы. Очень высокому уровню загрязнения соответствуют нарушения, при которых полностью исключается возможность роста микроорганизмов.

Использование метода ИМС открывает новые возможности для индикации уровня загрязнения почвы, которая когда-либо обрабатывалась пестицидами. Метод ИМС может служить для индикации уровня загрязнения, который диагностируется по типу реакции сообщества амилолитических микроорганизмов. Определив уровень загрязнения, можно прогнозировать и норму нагрузки того или иного пестицида на почву.