Протеазы растительного происхождения

Папаин (Н.Ф. 3.4.22.2) и химопапаин (Н.Ф. 3.4.22.6).Папаин является наиболее применяемым в производстве протеолитическим ферментом. Ферменты папаин и химопапаин истинные ферменты латекса плодов дынного дерева (Carica papaya).

Эти ферменты относятся к группе тиоловых протеиназ; характерной особенностью которых является то, что они активируются сульфгидрильными соединениями: восстановленным глутатионом, цистеином. Папаин и химопапаин получены в кристаллическом состоянии. Их молекулярная масса 20700 и 36000 Да соответственно, а изоэлектрические точки равны 8,75 для папаина и 10,1 для химопапаина. Оптимальная зона рН для действия папаина зависит от природы гидролизуемого белка и может быть слабокислой, нейтральной или слабощелочной.

Химопапаин имеет большое сходство с папаином, однако, можно выделить и некоторые интересные отличия. Например, активность химопапаина при гидролизе гемоглобина и казеина в два раза ниже, чем у папаина; он более термоустойчив, чем папаин, и проявляет хорошую стабильность в кислой среде (рН 2,0).

Папаин обладает довольно широкой специфичностью. Он преимущественно гидролизует вторую пептидную связь, лежащую за карбоксильной группой фенилаланина.

Различные фирмы, как зарубежные, так и отечественные, выпускают ферментные препараты на основе папаина с различной степенью очистки. Возможности их использования обширны: кожевенная промышленность (при обезволашивании и мягчении шкур); кинопроизводство (для растворения желатинового слоя на пленках при их регенерации); парфюмерия (при создании добавок в кремы, лосьоны, зубные пасты); производство синтетических моющих средств (для удаления загрязнений белковой природы); медицина (при лечении воспалительных процессов, ожогов, тромбозов и др.); пищевая промышленность (виноделие, пивоварение, производство спирта, хлебопечение, сыроделие и др.).

Фицин (Н.Ф. 3.4.22.3) и бромелаин (Н.Ф. 3.4.22.5).Фицин выделяют из млечного сока фикусовых растений, например, инжира (Ficus carica). Также как и папаин он относится к тиоловым протеиназам. Еще один тиоловый фермент бромелаин получают из свежего сока ананаса (Bromeliacea). Оба эти фермента имеют сходство с папаином, проявляют наибольшую активность в нейтральной зоне рН, обладают широкой специфичностью, предпочтительно расщепляют пептидные связи, образованные положительно заряженными аминокислотами.

Использование бромелаина и фицина аналогично использованию папаина; в последние годы их производство возросло, и в настоящее время эти ферменты применяют для удаления белковой мути в пиве и для мягчения мяса.

Протеолитические ферменты семян растений.В семенах злаковых и бобовых культур содержится целый комплекс протеолитических ферментов, который участвует в расщеплении запасных белков до аминокислот в процессе прорастания семян. Были выделены несколько типов протеолитических ферментов, различающихся по оптимуму рН: кислые протеиназы с оптимумом рН 3,7–4,0; нейтральные протеиназы с оптимумом рН 6,5–7,0; щелочные протеиназы с оптимумом рН > 8,0.

Из трех групп протеиназ наибольшего внимания технологов заслуживают нейтральные протеиназы. По активности они в несколько раз превосходят кислые и в условиях теста способны эффективно расщеплять белки клейковины. Одна из особенностей нейтральных протеиназ состоит в том, что они прочно связаны с белками клейковинного комплекса и извлекаются при частичном растворении клейковины в щелочном растворе (0,35%-ным раствором карбоната натрия). В созревших семенах пшеницы нейтральные протеиназы и их белковые ингибиторы образуют единый неактивный комплекс, связанный с клейковиной. Соотношение активности протеиназ и их ингибиторов в созревшем зерне определяет стабильность белкового комплекса, его устойчивость в процессе тестоведения.

Нейтральные протеиназы не активируются восстановленным глутатионом или цистеином и, поэтому, не могут быть отнесены к тиоловым ферментам, в отличие от кислых протеиназ. Нейтральные протеиназы ингибируются хлоридом натрия, фенольными соединениями, ароматическими аминокислотами, продуктами сахароаминной реакции (меланоидинами). Хлорид натрия является обязательным компонентом рецептуры и, внесенный в таком количестве, снижает активность нейтральных протеиназ и соответственно интенсивность автолиза на 60–70%. В зависимости от качества муки и состояния ее клейковинного комплекса технолог может варьировать время внесения соли и, тем самым, регулировать интенсивность протеолиза.

В связи с этим необходимо еще раз подчеркнуть важность изучения собственных, эндогенных ферментных систем биологического сырья, факторов, влияющих на их активность, с точки зрения их огромной роли в процессах, происходящих при созревании, хранении и переработке пищевого сырья.

Протеазы животного происхождения.Протеазам животного происхождения принадлежит огромная роль в процессах пищеварения. Они были одними из первых ферментов, которые получены в высокоочищенном кристаллическом состоянии и детально изучены. Именно они стали объектами для расшифровки структуры активного центра и механизма каталитической активности. Кроме того, эти ферменты, благодаря своей высокой специфичности, сами явились инструментами для расшифровки первичной структуры белков, изучения регуляторных функций протеаз в метаболизме клетки.

Трипсин (Н.Ф. 3.4.21.4). Трипсин — сериновая протеиназа. Молекулярная масса около 23800 Да. Изоэлектрическая точка 10,6; оптимум рН действия находится между 7,0–9,0 для белков и синтетических субстратов.

Трипсин проявляет высокую специфичность к определенным пептидным связям. Он осуществляет гидролиз пептидных связей, образованных карбоксильными группами аргинина и лизина. Трипсин секретируется поджелудочной железой в виде зимогена — трипсиногена, неактивного предшественника и активируется либо энтерокиназой, либо аутокаталитически активным трипсином по механизму ограниченного протеолиза. Превращение трипсиногена (229 аминокислотных остатков и молекулярная масса около 24000) в трипсин (223 аминокислотных остатка) можно представить следующим образом: разрыв одной единственной пептидной связи между Лиз-Иле, отщепление N-концевого гексапептида Вал-Асп-Асп-Асп-Асп-Лиз приводит к образованию активной формы фермента.

Высокоочищенный трипсин применяется для медицинских целей. Это одна из главных протеаз поджелудочной железы, которая в виде неочищенного панкреатина находит некоторое применение в пищевой промышленности для производства гидролизатов.

Химотрипсин (Н.Ф. 3.4.21.1). Химотрипсин — протеолитический фермент, секретируемый поджелудочной железой в тонкий кишечник в виде неактивного предшественника, называемого трипсиногеном. Химотрипсиноген (молекулярная масса около 25000) представляет собой полипептидную цепь, состоящую из 245 аминокислотных остатков и содержащую пять дисульфидных связей. Он активируется в тонком кишечнике под действием трипсина. При этом происходит гидролиз четырех пептидных связей и отщепление двух дипептидов (14–15 и 147–148). В результате образуется активный химотрипсин, состоящий из трех полипептидных цепей, ковалентно связанных двумя дисульфидными мостиками.

В активном центре химотрипсина содержится остаток гистидина (57), аспарагиновой кислоты (102) и остаток серина (195). Молекулярная масса около 22500 Да. Изоэлектрическая точка 8,3; оптимум рН в пределах 7,0–9,0, что согласуется с естественными условиями его действия.

Специфичность химотрипсина заключается в том, что он предпочтительнее гидролизует пептидные связи, образованные ароматическими аминокислотами: тирозином, триптофаном, фенилаланином.

Этот фермент не применяется в пищевой промышленности как таковой, но является составной частью комплексных препаратов панкреатина.

Пепсин (Н.Ф. 3.4.23.1).Пепсин вырабатывается слизистой желудка в виде пепсиногена (молекулярная масса около 42000 Да). Пепсиноген превращается в активный пепсин под действием HCl или аутокаталитически путем расщепления одной пептидной связи. Фермент получен в кристаллическом виде, его молекулярная масса 35000 Да, оптимум рН действия 1,8.

Пепсин является кислой (карбоксильной) протеиназой. Его специфичность выражается в преимущественном гидролизе пептидных связей, образованных аминными группами фенилаланина и тирозина.

Пепсин имеет огромное значение как пищеварительный фермент, он входит в состав лекарственных ферментных препаратов, тонизирующих средств, жевательной резинки. В пищевой промышленности пепсин используют для свертывания казеина молока и для растворения белковой мути в пиве.

Реннин (Н.Ф. 3.4.23.4).Этот фермент, имеющий много сходства с пепсином, содержится в соке четвертого отдела желудка телят. Реннин образуется из предшественника — прореннина. Его молекулярная масса около 40000 Да, изоэлектрическая точка около 4,5. Оптимум рН действия фермента 3,7. Реннин представляет собой мощную протеазу, осуществляющую свертывание молока; он является основным компонентом неочищенных экстрактов и комплексных промышленных препаратов, используемых для этой цели.

Казеин молока (78% всех азотистых веществ молока) является фосфопротеидом, содержащим около 6–10% углеводов. Он не осаждается ионами Са²⁺; действие реннина приводит к образованию гликопротеида, содержащего 20–30% углеводов и пара-казеина. Последний осаждается в присутствии ионов Са²⁺ и способствует осаждению других фракций казеина.

Микробные протеазы. Число микроорганизмов, продуцирующих протеазы чрезвычайно велико. Специфичность этих ферментов, во многих случаях более широкая, чем специфичность хорошо изученных ферментов животного происхождения, что затрудняет их классификацию.

Микробные протеазы (грибные и бактериальные) находят широкое применение в различных отраслях промышленности. Среди них есть ферменты, имеющие оптимумы в нейтральной, кислой и щелочной зонах рН; некоторые из них проявляют трипсинопободное действие, другие являются пепсиноподобными ферментами, третьи — тиоловыми, четвертые имеют пептидазную активность и т.д. Многие из них были выделены в виде высокоочищенных препаратов и подробно охарактеризованы.

Наибольшее применение нашли щелочная сериновая протеаза из Baсillus licheniformis, которая используется в моющих средствах; протеаза из Mycor, которая заменила телячьи сычуги в производстве сыра, а также грибная протеаза из A. oryzae (в комплексе с амилазой), используемая в хлебопечении.

Протеазы — наиболее важные промышленные ферменты. Уровень потребления препаратов микробных протеаз около 40% от всех используемых ферментов

Субтилизин Калсберга (Н.Ф. 3.4.21.14). Кристаллическая форма этого фермента впервые была получена в 1952 г., и с тех пор субтилизин является наиболее важной промышленно используемой микробной протеазой. Он продуцируется В. Subtilis и B. licheniformis.

Этот фермент состоит из одной полипептидной цепочки (214 аминокислотных остатка), среди аминокислот отсутствует цистеин. Молекулярная масса фермента 27277 Да, изоэлектрическая точка 9,4; оптимум рН 8,0–9,0. Фермент отличается высокой рН-стабильностью в диапазоне от 5,0 до 11,0.

Субтилизин Калсберга является сериновой протеиназой, обладает широкой специфичностью, предпочтительнее гидролизует пептидные связи, образованные ароматическими аминокислотами.

Ренниноподобные кислые протеазы.Наиболее важные с практической точки зрения кислые протеазы, используемые при производстве сыров образуют культуры Mucor pusillus и Mucor mieher.

Протеазы из Mucor pusillus имеют молекулярную массу 30000 Да, состоят из одной полипептидной цепочки, оптимум рН действия по казеину 4,5, по гемоглобину 4,0.

Протеазы из Mucor mieher имеют бóльшую молекулярную массу 38000 Да, содержат около 6% углеводов и проявляют максимальную активность по гемоглобину при рН 4,5.

Нейтральные протеазы аспергиловых грибов.Из культуры А. оryzae были выделены две нейтральные металлопротеиназы. Одна из них имеет оптимум рН 7,0, однако быстро инактивируется при 50⁰С. Другая обладает более низким оптимумом рН 5,5–6,0, но проявляет высокую термостабильность (10 минут, 90⁰С — остаточная активность 10%).

Протеазы из различных штаммов А. оryzae или из одних штаммов, но растущих при разных условиях, неодинаково влияют на процесс хлебопечения, даже в том случае, если доза фермента стандартизирована. Это объясняется тем, что промышленные препараты содержат различные количества протеолитических компонентов из А. оryzae, а также влиянием многообразных внешних и внутренних факторов на протеолиз белков муки.

В настоящее время многие отрасли пищевой промышленности — хлебопечение, виноделие, пивоварение, производство спирта, сыроделие, производство чая, органических кислот, аминокислот, витаминов, антибиотиков — основаны на использовании различных ферментативных процессов. Если еще на заре цивилизации человек использовал в своей практической деятельности спиртовое и молочнокислое брожение, сычуг для приготовления сыров, солод для осахаривания крахмалистого сырья, закваски при изготовлении хлеба, то сегодня использование ферментов превратилось в важнейший промышленный принцип совершенствования пищевых технологий.