Иммобилизованные биокатализаторы

Работа биологического реактора в основном определяется свойствами применяющихся биокатализаторов. Ранее мы обсуждали различные методы и способы использования ферментов, при помощи которых последние могли бы успешно выполнять свои каталитические функции. Кроме того, нами уже изучены методы генетической модификации клеток, позволяющие повысить выход синтезируемых ими ценных соединений. Прежде чем перейти к изучению реакторов других типов, познакомимся с еще одним типом биокатализаторов.

Этот раздел мы посвятим в основном изучению катализаторов на основе иммобилизованных клеток. В таких катализаторах клетки связаны или включены в структуры, позволяющие удерживать их в определенной зоне реактора. Клетки, как и ферменты, могут быть иммобилизованы путем их включения в небольшие частицы или посредством закрепления на поверхности этих частиц, или с помощью того или иного макроскопического барьера, препятствующего переносу клеток из одной зоны реактора в другую.

Прежде чем перейти к изучению методов иммобилизации клеток и некоторых экспериментов, выполненных к настоящему времени с участием такого рода катализаторов, мы должны ответить на вопрос, почему вообще возникает необходимость в иммобилизации клеток. Одно из преимуществ иммобилизованных клеток связано с возможностью достижения гораздо большей их плотности в культуре по сравнению с суспендированными клеточными системами. В биореакторах периодического действия иммобилизованные клетки обладают и некоторыми другими преимуществами. Так, некоторые клетки млекопитающих растут только в том случае, если они связаны с поверхностью, и, следовательно, для них иммобилизация является обязательным условием, а не одним из возможных вариантов. Кроме того, иммобилизованные клетки могут использоваться для создания специфических электродов, предназначенных для определения концентраций питательных веществ, метаболитов, лекарственных препаратов и токсичных веществ в биореакторах, а также в других процессах и в клинической практике. Иммобилизация клеток может оказаться полезной как средство для регуляции морфологии клеток и реологии бульонов. Действительно, рост микроорганизмов ограничен пустотами и поверхностями частиц носителя, что позволяет достаточно точно регулировать реологические свойства бульона и соответствующие параметры массопереноса, которые уже не изменяются в ходе процесса в такой степени, в какой это типично для периодического роста отдельных культур. Иммобилизация клеток создает возможность для осуществления непрерывного процесса без вымывания организмов и изменения их генетической природы, а в некоторых случаях позволяет непрерывно отделять продукт и удалять ингибирующие вещества. Как и в случае других иммобилизованных катализаторов, стоимость иммобилизованных клеток может быть довольно высока, и не обязательно будет компенсироваться указанными преимуществами.

В случае биореакторов непрерывного действия применение иммобилизованных клеток дает возможность расширить временной диапазон, в течение которого клетки проявляют свои каталитические свойства при осуществлении необходимой химической реакции или последовательности реакций. В отличие от иммобилизованных ферментных катализаторов иммобилизованные клетки выполняют целый спектр каталитических функций самой разнообразной сложности. Как схематично показано на рис. 26, катализаторы на основе иммобилизованных клеток могут быть нескольких типов в зависимости от того, какая часть метаболического аппарата клетки сохранила свою активность в данном процессе. При работе с суспензиями клеток для предотвращения их частичного вымывания необходимо, чтобы рост клеток осуществлялся и в реакторе. Рассмотренное в первых разделах этой главы повышение скорости разведения, отвечающей точке вымывания, за счет рециркуляции, по сути дела, представляет собой частичную иммобилизацию клеток в масштабе всего реактора.

РИС. 26. Различные уровни сложности сети реакций, осуществляемых катализаторами на основе иммобилизованных клеток.

Таким образом, можно повысить производительность процесса в какой-то мере независимо от скорости роста организмов. Если клетки полностью удерживаются в реакторе, то в силу отсутствия затрат питательных веществ и энергии на клеточный рост можно ожидать проявления полного спектра каталитической активности. В сущности в таких случаях клеточный рост часто вообще нежелателен, поскольку он может привести к снижению выхода необходимого продукта и поскольку накопление клеточной массы может нарушить гидродинамические и реологические свойства системы.

На самом низком уровне катализ иммобилизованными клетками сводится к проявлению активности одного или нескольких ферментов (без участия кофакторов). В этом случае иммобилизованные клетки выполняют ту же функцию, что и иммобилизованные ферментные катализаторы, и применение целых клеток целесообразно только с точки зрения снижения трудоемкости и стоимости процесса изготовления иммобилизованного катализатора. При использовании таких катализаторов следует, однако, учитывать трудности, связанные с дополнительным сопротивлением клеточной оболочки массопереносу и с возможностью расщепления необходимого фермента внутриклеточными протеазами. Впрочем, в других случаях нативное клеточное окружение может способствовать стабилизации некоторых ферментов.

Далее, не растущие иммобилизованные клетки могут катализировать многостадийные превращения, включая стадии утилизации и регенерации кофактора. Если в системе присутствуют все кофакторы, ферменты, субстраты и регенерирующие вещества, то в общем случае связанные с этими каталитическими процессами биосинтетические реакции и клеточный рост не нужны; если к тому же в организме уже существует определенный путь метаболизма с участием кофакторов, то иногда целесообразно использовать этот естественный путь, а не пытаться создать другой механизм утилизации и регенерации кофактора.

На следующем по степени сложности каталитической активности уровне осуществляются процессы биосинтеза и поддержания жизнедеятельности клеток, но их рост и деление несущественны. Наконец, в самом сложном случае активна вся метаболическая сеть, клетки растут и делятся. В упоминавшихся выше реакторах периодического действия с участием культур иммобилизованных клеток, например, возникает каталитическая активность именно этого наивысшего уровня сложности. Такой же уровень каталитической активности иммобилизованных клеток иногда целесообразен и в реакторах непрерывного действия с регенерацией катализатора, поскольку некоторые организмы плохо реагируют на среду, которая не способствует росту, и в таких условиях быстро теряют активность. Как мы увидим в приведенных ниже примерах, чередование условий процесса с менее сложным уровнем каталитической активности клеток до режима полного роста представляет собой обычный прием, позволяющий продлить срок службы катализатора.

Катализатор, который выполняет необходимые каталитические функции, но не инициирует большое число побочных реакций, имеет два преимущества. Первое из них связано с увеличением выхода продукта. Если субстрат можно стехиометрически превратить в конкретный продукт определенного пути метаболизма микроорганизмов, избежав при этом клеточный рост или образование других конечных веществ, то выход необходимого продукта в таких условиях, очевидно, будет максимальным. Другое преимущество обсуждаемых катализаторов заключается в более высокой общей скорости реакций. По мере усложнения каталитического процесса от простейшего одноферментного до наиболее сложного — полного клеточного роста (рис. 26)—резко возрастает и характерное время пребывания в реакторе, необходимое для существенного превращения субстрата. На одноферментном уровне скорости реакций определяются скоростями катализируемых ферментом отдельных элементарных стадий, которые обычно завершаются примерно за одну минуту. Напротив, время удвоения клеток, характеризующее время осуществления всей сети метаболических превращений, обычно составляет от нескольких часов до нескольких суток во всех случаях за исключением наиболее быстро растущих бактерий. Поэтому - по мере усложнения метаболических превращений (см. рис. 26) в общем случае значительно возрастает и время пребывания реакционной смеси в реакторе, необходимое для превращения значительной доли субстрата. Отсюда следует, что выгоднее использовать только ферменты и кофакторы, необходимые для данного превращения; если этот путь удается реализовать, то тем самым удается существенно сократить расчетное время пребывания компонентов в реакторе.

Закончив на этом изложение основ проблемы использования иммобилизованных клеток, перейдем теперь к изучению катализаторов на основе иммобилизованных клеток, методов их получения и изучения, а затем рассмотрим ряд примеров, иллюстрирующих различные области применения этих катализаторов.