Векторы для клонирования ДНК

В основе молекулярного клонирования лежит встраивание нужного фрагмента ДНК (вставки) в другую молекулу ДНК (вектор), которая способна включать в себя новые последовательности ДНК, обеспечивать их перенос в системы, где созданная in vitro ДНК будет воспроизводиться in vivo, давая начало новому клону клеток, отличному фенотипически от исходных клеток хозяина (реципиента). Исходя из этого, вектор, в данном случае генетический, представляет собой молекулу ДНК, которая должна соответствовать определенным требованиям.

1. Способность к автономной репликации, т.е. обладание ori (точка инициации репликации). Другими словами – генетический вектор должен содержать последовательности нуклеотидов, обеспечивающие не только его собственную репликацию, но и воспроизведение встроенной в него вставки чужеродной ДНК.

2. Наличие в структуре вектора хотя бы одного уникального, т.е. встречающегося на молекуле ДНК только один раз, сайта для какой-либо эндонуклеазы рестрикции, по которому происходит встраивание вставки ДНК.

3. Наличие в структуре ДНК вектора селективного маркера – гена или генов, кодирующих белки, которые отсутствуют в клетках реципиента, например – белки, обеспечивающие устойчивость к антибиотикам. Это обеспечивает возможность вести отбор клонов, содержащих вектор со встроенной вставкой ДНК.

4. Небольшой размер ДНК вектора.

5. Обеспечение достаточной копийности в клетке-хозяине.

Рассмотрим подробно группу векторов, которые носят название плазмидные, поскольку созданы на базе природных генетических элементов бактерий и удовлетворят практически всем требованиям, предъявляемым к генетическим векторам. Рассмотренные выше подходы манипулирования ДНК прежде всего применялись для создания удобных и надежных плазмидных векторов.

Плазмидные векторы

Плазмиды – это внехромосомные, встречающиеся в природе, кольцевые двуцепочечные молекулы ДНК, способные к автономной репликации внутри бактериальных клеток.

Природные плазмиды содержат в своем составе гены устойчивости к антибиотикам, ионам тяжелых металлов (R-плазмиды), а также гены, контролирующие катаболизм некоторых органических соединений (плазмиды биодеградации, или D-плазмиды). Продукты экспрессии плазмидных генов благодаря высокой копийности плазмид обеспечивают клетке синтез большого количества ферментов, которые инактивируют антибиотики или ксенобиотики, что и обеспечивает устойчивость (резистентность) к последним..

Благодаря небольшому размеру плазмидную ДНК довольно легко выделить в чистом виде. Плазмидные ДНК легко “поглощаются” бактериальными клетками, если их обработать ионами кальция. Попавшие в клетку-хозяин молекулы ДНК плазмид реплицируются, образуя множество себе подобных копий. Однако бактериальная клетка обычно может содержать в своем составе плазмиды только одного типа. Это явление называется “несовместимость плазмид”.

Число копий плазмиды в клетке может существенно варьировать и зависит как от генетических особенности бактерии-хозяина, так и от самой плазмиды. Плазмиды, находящиеся "под ослабленным контролем" со стороны хромосомной ДНК хозяина, могут быть представлены в клетке от 10 до 200 копиями. Если же плазмида находится "под строгим контролем", она реплицируется с той же скоростью, что и главная хромосома, следовательно, содержится в клетке в одной или нескольких копиях. Однако такие малокопийные плазмидные ДНК также используют для создания векторов. Дело в том, что под действием антибиотика хлорамфеникола прекращается репликация хромосомной ДНК и клетка не делится, но плазмидная ДНК в таких условиях реплицируется и получается увеличение числа копии этой ДНК.