Генетические векторы для клонирования ДНК

Когда рассматривается вопрос создания функциональной рекомбинантной ДНК, необходимо иметь в виду, что он касается не только конструирования с помощью биологических инструментов ДНК с новыми, заданными последовательностями нуклеотидов. Из системы in vitro, в которой полинуклеотиды с помощью ферментов образуют заданные новые последовательности, нужно осуществить переход in vivo, т.е., нужно перейти в живую систему, которая с помощью своих ферментных систем обеспечит основные генетические процессы: репликацию, транскрипцию и трансляцию. Матрицей для них будет созданная рекомбинантная ДНК. Таким образом, технология рекомбинантной ДНК подразумевает также систему “хозяин – рекомбинантная ДНК”. Окружающий нас живой мир многообразен, но управляющие им биологические законы универсальны. Именно это позволяет нам применять их для достижения собственных целей с помощью биотехнологии.

При создании рекомбинантной ДНК исследователь может преследовать разные цели. Первая, которая часто является и конечной целью – это наработка в достаточных количествах небольших фрагментов ДНК, необходимых для детального исследования всей исследуемой ДНК, например – полное секвенирование генома. Такая процедура называется клонированием, т.е. создается клон клеток, который содержит в составе рекомбинантной ДНК строго определенный участок изучаемой ДНК. Если же целью является изучение продуктов экспрессии каких-либо нуклеотидных последовательностей, то простого клонирования ДНК недостаточно. В этом случае конструируемая ДНК должна содержать определенные регуляторные последовательности, которые способны обеспечивать экспрессию последовательностей нуклеотидов в виде соответствующих мРНК, а затем и полипептидов.

Вставки ДНК

При конструировании рекомбинантных ДНК используют три источника ДНК-вставок:

1) геномная ДНК, фрагментированная либо с помощью физических методов, например, с помощью обработки ультразвуком, либо с помощью эндонуклеаз рестрикции;

2) синтетические фрагменты ДНК, полученные химическим или ферментативным методоми, либо при комбинировании этих методов;

3) фрагменты ДНК (кДНК), полученные с помощь обратной транскрипции in vitro.

При гидролизе ДНК эндонуклеазами рестрикции часто образуются фрагменты, которые без дополнительной модификации можно использовать в виде вставки при создании рекомбинантной молекулы ДНК. В других случаях концы фрагментов ДНК, которые будут использованы как вставки, подвергают различным модификациям с помощью ферментов-инструментов.

Вставки геномной ДНК. Под геномной ДНК подразумевается совокупность всех последовательностей ДНК данного организма, обеспечивающая полное воспроизведение его в потомстве. В клетках эукариот (например, животных или растений) ДНК находится в ядре клетки в составе хромосом (ядерная или - хромосомная ДНК), а также в некоторых клеточных органоидах - митохондриях и пластидах (митохондриальная и хлоропластная ДНК). В клетках прокариотических организмов (бактерий и архей) кольцевая или линейная молекула ДНК прикреплена изнутри к клеточной мембране. У прокариот, как и у низших эукариот (например, дрожжей), встречаются также небольшие автономные, преимущественно кольцевые, молекулы ДНК, называемые плазмидами. Кроме того, одно- или двухцепочечные молекулы ДНК могут образовывать геном ДНК-содержащих вирусов.

Метод получения фрагментов ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции отличается высокой воспроизводимостью. Специфические ферменты разрезают данную ДНК с образованием уникального набора фрагментов. При получении необходимого для работы фрагмента, находящегося в пуле продуктов рестрикции, необходимо провести обогащение смеси нужным фрагментом ДНК. С помощью методов электрофореза в полужидкой среде, а также жидкостной хроматографии высокого разрешения с обращенной фазой можно получить значительное обогащение смеси требуемым фрагментом ДНК. Следующим этапом является идентификация специфических фрагментов, которые часто называют ДНК-мишень или ДНК интереса.