Культивирование протопластов

Методы культивирования протопластов соответствуют тем, которые применяются для выращивания клеток. Протопласты высевают как на жидкие, так и на агаризованные среды того же состава с различными концентрациями агара.

Основное требование к применяемым средствам состоит в том, чтобы в процессе культивирования не происходило разрушения протопластов и среда была оптимальна для образования клеточных колоний. До тех пор, пока протопласты не образовали клеточную стенку, они представляют собой очень нежные структуры и работа с ними должна проводиться в мягких условиях.

Условия, в которых культивируются протопласты, в основном соответствую тем, которые применяются для выращивания в культуре клеток растений. Состав минеральных солей может несколько изменяться. Как правило, среда должна состоять из соматического стабилизатора, неорганических соединений, источников углерода, витаминов, источников органического азота и фитогормонов.

Манит, сорбит и их комбинация могут быть использованы в качестве осмотических стабилизаторов. За основу берется состав минеральных солей в средах для культивирования клеток растений. Можно менять соотношения аммонийного и нитратного азота в зависимости от потребности в них клеток, увеличивать концентрацию CaCl2 для стабилизации образующейся клеточной стенки. После того как образовались и начали делиться клетки, они могут быть помещены в условия культивирования, применяемые обычно для клеток растений.

В первые сутки культивирования некоторое число протоплатов погибает, что может быть связано с гетерогенностью популяции по отношению к действию осмолитиков. Оставшиеся протопласты уже через несколько часов начинают синтезировать клеточную стенку. Полностью этот процесс завершается при правильно подобранных условиях выделения и культивирования на 1-4 сутки. При этом протопласты теряют сферическую форму, клетки удлиняются. Скорость регенерации клеточной стенки зависит от вида растения и ткани, из которой получены протопласты, а также от степени ее дифференцировки. При неблагоприятных условиях выделения и культивирования протопластов клеточные стенки образуются не по всей поверхности. В местах разрывов часть протоплазмы выходит, оставаясь окруженной плазмалеммой. В ней могут находиться вакуоли. Это так называемые почки. «Почкование» происходит при повышенной концентрации осмотически активного вещества в присутствии неподходящего для данной культуры сахара, при низком содержании CaCl2 и др.

При правильно подобранных условиях выделения и культивирования к третьим-четвертым суткам с момента высева наблюдаются первые деления протопластов. В большинстве случаев затем образуются многоклеточные агрегаты, развивающиеся в дальнейшем в каллус, который способен регенерировать целое растение. Растения-регенераты из протопластов получены в настоящее время для люцерны, табака, моркови, томата и целого ряда других сельскохозяйственно важных растений.

Перспективы получения лекарственных средств на основе клеток растений

Преимущества получения ряда фармакологических веществ из растений заключается в следующем:

• независимость от климатических, сезонных и географических условий;

• стабильность выпуска продукции в течение года;

• уменьшение площади почвы, вовлеченной в хозяйственный оборот.

На основе культуры клеток можно:

• получать известные вещества, присущие определенному растению, такие как никотин, кодеин, хинин, сапонины и др.;

• обеспечить синтез новых продуктов из трудно выращиваемых растений, например адаптоген из корня женьшеня;

• получать новые вещества;

• использовать системы клеток для биотрансформации конечного продукта.

В настоящее время существует промышленное получение ряда ценных веществ из растительной биомассы методом in vitro. Хорошо налажен в Японии выпуск таких лекарственных препаратов: шикоин (из воробейника аптечного), убихинон (из табака, дигоксин (из наперстянки шерстистой), диосгенин (диоскорея дельтовидная).

промышленное производство лекарственных веществ на основе культур клетки гарантирует достаточный выход продукта. Это можно подтвердить путем сравнения процента выхода активного начала из биомассы цельного сырья взятого в эквивалентном количестве. Например, получение антрахинонов из кассии:

• биомасса – 0,334%; цельное растение 0,209% сухой массы;

• диосгенин – клубень, 26 мг на 1 г сухой массы, биомасса – 26 г на 1 г сухой массы.

В 60-х годах была доказана способность клеток и тканей растений к росту, делению, органообразованию и вторичному метаболизму, т.е. способностью любой клетки образовывать полноценное растение, поскольку генетический и физиологический потенциал, необходимый для вторичных метаболитов присутствует в каждой клетке.

Для выращивания культур необходимы высокопродуктивные клетки растения. Так для выращивания родиолы розовой более перспективными являются клетки корневой системы.

Для обеспечения роста и синтеза продуктов вторичного метаболизма необходим подбор ингредиентов среды культивирования, которые проводят по двум направлениям и оценивают:

- влияние среды на формирование биомассы;

- влияние состава среды на синтез вторичных продуктов.

Компоненты среды для выращивания культур клеток растений должны включать: основные неорганические питательные вещества, источники железа, органические добавки (витамины, регуляторы роста), источники углерода, о чем говорилось выше.

Существует несколько стандартных питательных сред, широко используемых при культивировании, но количество регуляторов роста в них варьирует в зависимости от вида растений. на выход продукта может влиять концентрация источника углерода и других компонентов среды. Так в культуре клеток Барвинка розового увеличение выхода алкалоидов было связано с увеличением в среде концентрации сахарозы, а в культуре клеток моркови накопление антоциана стабилизировалось, когда в качестве лимитирующего фактора использовали фосфаты.

В качестве регуляторов роста и синтеза продуктов вторичного метаболизма используют ауксины, среди которых индолил-3-уксусная кислота, нафтилуксусная кислота, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, а также цитохинины. На синтез вторичных метаболитов влияют внесенные в питательную среду извесные предшественники, которые могут стимулировать определенные ферментативные пути метаболизма. Так внесение фенилаланина в среду для культивирования клеток увеличивало выход диосгенина примерно на 100%. На степень накопления вторичных метаболитов влияют также свет, температура, pH, а при суспензионном суспензировании культивировании – аэрация и перемешивание, скорость вращения сосудов, газовый состав и т.д.

Таким образом, создавая для каждой культуры клеток растений благоприятные условия на стадии роста и синтеза вторичных метаболитов, можно гарантировать получение любого продукта с метаболической активностью.

Для накопления промышленного сырья путем выращивания клеток и тканей растений используют каллусные и суспензионные культуры, последние получают из каллусных.

Технология получения растительного сырья на основе каллусных культур имеет ряд преимуществ – это надежность и стабильность выхода биомассы и продуктов вторичного метаболизма, а также возможность использования каллусной системы для иммобилизации и последующей биотрансформации, но обладает существенным недостатком – необходимостью применения ручного труда.

В России разработана технология получения субстанций женьшеня, родиолы розовой, унгерии на основе каллусных культур. Данные препараты нашли применение в медицине, косметике и пищевой промышленности. при внедрении технологии суспензионного культивирования необходимо учитывать основные свойства растительных клеток: клетки растений в 50-100 раз больше, чем клетки грибов; в результате роста клетки увеличиваются в размерах, в них появляется большая вакуоль; суспензионные культуры состоят из клеточных агрегатов; наличие целлюлозной клеточной оболочки; интенсивность дыхания.

Выращивание растительных клеток осуществляется в сосудах различного объема (до 200 литров) с системами перемешивания (турбинное, восходящими потоками воздуха, встряхивания).

В настоящее время применяют многостадийные способы получения биомассы и продуктов вторичного метаболизма:

- выращивание в аэрируемом реаторе;

- перенос клеток из одной среды в другую, более богатую микро- и макроэлементами, питательными веществами, но лишенную органических добавок;

-последующее добавление в конце цикла органики.

В основном клетки выращивают в периодическом реакторе. Для повышения выхода продуктов вторичного метаболизма разрабатываются применительно к растительным клеткам методы иммобилизации, биотрансформации. На моделях ряда клеточных культур, например, кукурузы было показано, что синтез и накопление вторичных метаболитов связаны с агрегатным состоянием, отмечается, что чем ближе клетки и группы клеток к целому растению, тем выше у них метаболический потенциал. Имеется, однако, много данных об обратной зависимости между агрегатным состоянием и накоплением вторичных метаболитов. Это связано с двумя типами механизмов. Первый основан на том, что определяет уровень агрегации клеток, а достаточная ее степень может быть достигнута в медленно растущих культурах. Второй механизм связан с кинетикой скорости роста и предполагает, что первичные и вторичные пути метаболизма по-разному конкурируют за предшественники в быстро и медленно растущих клетках.

Исходя из выше сказанного, очевидно, что иммобилизированные клетки, обладающие низкой скоростью роста, способны к интенсивной выработке метаболитов. Одно из условий при иммобилизации клеток – выделение метаболита в питательную среду, из которой он может быть легко извлечен. К таким культурам относятся клетки, продуцирующие алкалоиды. Преимущества иммобилизированных клеток по сравнению с суспензионными культурами следующие:

- многократное использование биомассы;

- четкое отделение биомассы от продуктов метаболизма;

- увеличение продолжительности культивирования на стадии продуцирования;

- получение большого количества вторичных метаболитов.

Другим перспективным вариантом использования культур клеток растений в фармацевтической промышленности следует считать их применение для биотрансформации.

Биотрансформация – метод, использующий ферменты, локализованные в клетке растения, которые способны менять функциональные группы добавленных извне химических соединений. Этот метод пригоден для повышения биологической активности данной конкретной химической структуры и осуществления серии специфических химических реакций за счет включения одного или нескольких последовательно связанных ферментов.

Возможность применения биотрансформации при синтезе некоторых соединений была показана на примере превращения дигитоксина в дигоксин клетками Digitalis lanata (наперстянки шерстистой). После 10-дневной инкубации клеток D.lanata в «ростовой» питательной среде (Мурасигё и Скуга) культуру клеток переносили в «продукционную» среду (8% раствор глюкозы) с субстратом для биотрансформации – дигитоксином. В этих условиях весь дигитоксин в течение 2 дней трансформировался в деацетиллантозид С (дигоксин) и пурпургликозид А 88% и 12% соответственно.

Дигитоксин и дигоксин принадлежат к группе "карденолидов", применяемых для лечения хронической болезни сердца.

В настоящее время названные соединения стоят на шестом и восьмом месте в списке наиболее распространенных препаратов США, но использование дигоксина предпочтительнее из-за его меньшей токсичности, по сравнению с таковой у дигитоксина. Оба соединения в США получают путем экстрагирования плантационно выращиваемых растений, но при этом выделяется в основном дигитоксин.

Недифференцированные культуры Digitalis не образуют сердечных гликозидов, но могут осуществлять определенные реакции биотрансформации субстратов, добавленных в питательную среду. Биотрансформация дигитоксина в дигоксин происходит за счет реакции 12-гидроксилирования, катализируемой ферментом, содержащимся в клетках Digitalis lanata. Работа была проведена с использованием свободных недифференцированных суспензионных культур в Германии в 1977 г, а к настоящему времени внедрена в производство; достигнут выход дигоксина в пределах 700 г/л в 20-ти литровом реакторе за 17 суток культивирования. Таким образом, основные проблемы, связанные с биотрансформацией сердечных гликозидов клетками Digitalis lanata в настоящее время разрешены. Однако для дальнейшего развития этого направления необходима дальнейшая селекция специализированных линий клеток и оптимизация условий их культивирования, сокращение времени ферментации и увеличение срока работы клеток. Основные условия для перевода лабораторных методов культивирования клеток растений в промышленное производство – это экономически оправданные и относительно простые технологии культивирования клеток и выделения конечных продуктов.

Например, производство аймалина на основе меристемных культур Раувольфии стало реальным, когда в ходе селекционной работы и отбора были получены субклоны клеток, которые синтезируют этот алкалоид на порядок выше, чем исходные материнские штаммы.

Производство серпентина на основе суспензионных культур частично дифференцированных клеток меристемы Catharatus roseus оказалось эффективным и экономически оправданным лишь после того, как были получены субклоны, способные накапливать за 10-ти суточный цикл выращивания до25 г сухого вещества на 1 литр суспензионной культуры.

Аналогичная ситуация имела место и при организации биотехнологического производства настойки женьшеня. Количественный выход биологической субстанции в пересчете на сухое вещество каллуса женьшеня было ниже, чем из женьшеня, полученного при плантационном выращивании, примерно в 3-4 раза.

Производство био-женьшеня стало экономически оправданным лишь после того, как удалось повысить продуктивность его каллусных культур, сохранив без изменений реактогенные свойства экстрагируемых лекарственных настоек. Оказалось, что чем более дифференцированы клетки меристемы в культуре, тем выше их продуктивность. Разработана технология получения в культуре так называемых «бородатых» корней, где по условиям роста в скоплении клеток возникают субпопуляции с повышенной дифференцировкой. Эти популяции являются самыми продуктивными по биологически активным веществам.

1.