Способы определения резус-фактора

Все методы определения резус-фактора делят на способы, применяемые в клинической практике, и лабораторные способы.

Способы определения Rh₀(D) в клинической практике

Экспресс-метод определения стандартным универсальным реагентом в пробирке без подогрева

Для исследования можно использовать свежую несвернувшуюся кровь, взятую из пальца (или вены) непосредственно перед исследованием, или консервированную кровь без предварительной обработки, а также эритроциты из пробирки после формирования сгустка и отстаивания сыворотки.

Методика проведения реакции.Исследование проводят в центрифужных пробирках объёмом не менее 10 мл. На дно пробирки вносят одну каплю стандартного универсального реагента, представляющего собой антирезусную сыворотку группы АВ(IV), разведённую 33% раствором декстрана, например полиглюкина (ср. мол. масса 50 000-70 000). Затем в неё добавляют одну каплю исследуемой крови (или эритроцитов). Круговым вращением пробирки содержимое размазывают по её внутренней поверхности таким образом, чтобы содержимое растеклось по стенкам. Это значительно ускоряет агглютинацию и делает её крупнолепестковой. Агглютинация на стенках пробирки наступает, как правило, в течение первой минуты, но для образования устойчивого комплекса антиген-антитело и чёткой агглютинации наблюдать следует не менее 3 мин. Затем для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавляют 2-3 мл физиологического раствора и перемешивают путём одно-двукратного перевертывания пробирки (без взбалтывания!).

Трактовка результатов.Наличие агглютинации (крупные хлопья на фоне просветлённой жидкости) указывает на резус-положительную принадлежность исследуемой крови. Отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная розовая жидкость) свидетельствует о резус-отрицательной принадлежности исследуемой крови.

Реакция с цоликлоном анти-D - моноклональными антителами

На планшете смешивают большую каплю (0,1 мл) цоликлона анти-D и маленькую каплю (0,01 мл) исследуемой крови.

За реакцией наблюдают в течение 3 мин. При смешивании цоликлона анти- D с образцами резус-положительных эритроцитов отмечают быстро наступающую лепестковую агглютинацию. Если кровь резус-отрицательная, агглютинация отсутствует.

Определение антигенов CDE с помощью гель-карт.

Используются гель - карты для одновременного определения антигенов А, В, С, D, E, в которых антитела к ним уже присутствуют в микропробирках с гелем.

Лабораторные способы определения резус-фактора

Для определения резус-принадлежности крови больного в условиях лаборатории применяют четыре основных метода.

Метод агглютинации в солевой среде

Используют специальные сыворотки, содержащие полные антитела анти-резус. Эритроциты в виде 2% взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия соединяют в пробирках с антирезусной сывороткой. Пробирки помещают на 1 ч в термостат при температуре 37 °С, после чего осадок эритроцитов на дне пробирки рассматривают с помощью лупы и по его форме учитывают результат. При положительном результате (Rh⁺⁾ осадок имеет характерный рисунок в виде нитей или зернистости. При отрицательном (Rh^-) осадок размещается равномерным слоем и имеет вид правильно очерченного круга.

Метод агглютинации в присутствии желатина

B две пробирки помещают по 0,02-0,03 мл осадка исследуемых эритроцитов. Затем в первую пробирку добавляют 2 капли (0,1 мл) 10% раствора желатина и 2 капли (0,1 мл) анти-резусной сыворотки, во вторую (контрольную) пробирку - 2 капли (0,1 мл) 10% раствора желатина и 2 капли (0,1 мл) физиологического раствора.

Содержимое осторожно перемешивают. Затем пробирки инкубируют в термостате при температуре 45-48 °С в течение 30 мин, после чего добавляют 5-8 мл физиологического раствора и переворачивают пробирки 1-2 раза для перемешивания.

Результат учитывают, просматривая пробирки на свет невооружённым глазом или через лупу. Если эритроциты резус-положительны, произойдёт их агглютинация. Отсутствие агглютинации свидетельствует о том, что испытуемая кровь резус-отрицательная. B контрольной пробирке агглютинация эритроцитов должна отсутствовать.

Непрямой антиглобулиновыи тест (реакция Кумбса)

Эта реакция наиболее чувствительна для выявления неполных антител к ауто- и изоантигенам эритроцитов. К ней, как правило, прибегают при возникновении трудностей в определении резус-принадлежности крови, связанных с нечёткими результатами, полученными при других методах исследования. Реакция основана на использовании антиглобулиновой сыворотки.

При обработке резус-положительных эритроцитов неполными антителами анти-Rh наступает их обволакивание, сенсибилизация по отношению к антиглобулиновой сыворотке, которая агглютинирует сенсибилизированные эритроциты, поскольку имеет антитела к глобулинам.

В пробирку вносят антирезусную сыворотку и отмытые физиологическим раствором эритроциты, помещают на 1 ч в термостат при температуре 37 °С, после чего эритроциты тщательно отмывают. Последующий этап реакции проводят на плоскости. Каплю взвеси эритроцитов смешивают с равным количеством антиглобулиновой сыворотки и учитывают результат. Наличие агглютинации - показатель того, что исследуемый образец крови резус-положительный. Если агглютинация отсутствует, то испытуемая кровь резус-отрицательная.

Возможные ошибки

Чаще всего ошибки бывают следствием методических погрешностей при проведении исследования, в особенности при использовании конглютинационных методов. К ложным результатам могут привести неправильное соотношение между сывороткой и эритроцитами, преждевременная оценка результатов, оценка результатов по высыхающей капле, определение резус-фактора в гемолизированном и длительно хранящемся образце крови, а также использование неактивных, инфицированных и загнивших сывороток или сывороток с истекшим сроком годности.

Причиной ошибок могут быть биологические особенности испытуемой крови: снижение агглютинабельности резус-антигена при некоторых заболеваниях печени, почек, системы крови, а также неспецифическая агглютинация испытуемых эритроцитов. B случае сомнительных результатов исследование повторяют, применяя более активные антирезусные сыворотки.