В организм животного

Микроинъекция раствора ДНК.

Получение трансгенных животных путём микроинъекции гена включает следующие этапы:

1. Гормональную индукцию охоты и полиовуляции по имеющейся для каждого вида животных схеме;

2. Осеменение;

3. Извлечение оплодотворённых яйцеклеток посредством промывания яйцеводов, полученных от забитых на мясокомбинате животных-доноров.

4. Проведение микроинъекции в зиготу. Для этого необходимо осуществление следующих мероприятий:

-на максимально устойчивый рабочий стол устанавливают микроскоп, два микроманипулятора для управления удерживающей и инъекционной пипетками и прибор для регулирования инъекционного давления (рис. 9.5;1);

- на столике микроскопа устанавливают инъекционную камеру со средой, покрытой парафиновым маслом;

- в среду помещают зиготы;

- кончик инъекционной пипетки (внутренний диаметр не более 1 мкм) наполняют раствором ДНК (рис. 9.5;2);

-для инъекции зиготы фиксируют на удерживающей пипетке так, чтобы инъецируемый пронуклеус был хорошо виден (рис. 9.5;3);

- для инъекции пипетку через прозрачную оболочку и клеточную мембрану вводят в пронуклеус (ядро), после чего в него инъецируют 1-2 пкл раствора ДНК (9.5;4).

- о точности операции судят по набуханию пронуклеуса. Только такое визуальное увеличение объёма ядра свидетельствует о том, что раствор ДНК был действительно введён в пронуклеус;

1 2 3 4 5

Рис. 9.5. Основные элементы технологии микроинъекции раствора

ДНК в пронуклеусы

- после инъекции эмбрионы освобождают от удерживающей пипетки и культивируют до момента пересадки реципиентам.

5. Пересадка реципиентам. Коровам и кобылам – реципиентам пересаживают по 2 эмбриона (по 1 в каждый рог матки) на 7 день культивирования в стадиях поздней морулы или ранней бластоцисты. Каждому реципиенту мыши, кролика и свиньи пересаживают 20-30 инъецированных зигот, причём у свиней все они трансплантируются в один яйцевод, а у мышей и кроликов – раздельно по яйцеводам. У овец и коз каждому реципиенту пересаживают по три - четыре эмбриона (рис. 9.5;5).

6. Животных, родившихся из инъецированных эмбрионов, индивидуально метят, берут у них пробу крови для доказательства интеграции ДНК. Интеграцию ДНК проверяют дот-блот-гибридизацией по Саузерну.