Общая характеристика сырья для биотехнологических производств. Основные требования и ограничения к нему

Питательные среды для культивирования любого биотехнологического объекта содержат большое количество компонентов, основным из кото­рых считают тот, который является для него источником углерода и энер­гии. Это вещество называют субстратом, а все остальные - компонентами питания, без которых невозможно его нормальное развитие или его био­синтетическая активность.

Питательные среды готовят из различных видов сырья, которые услов­но делятся на две группы: синтетические и комплексные. Первые пред­ставляют собой индивидуальные соединения, для которых известен точ­ный химический состав, например глюкоза, сахароза (сахар), крахмал, этанол, низшие спирты и органические кислоты, углекислота, метан, n-парафины и пр. Вторые - сложную смесь органических веществ, в кото­рой, как правило, известно содержание одного «главного» ингредиента, влияющего на рост или биосинтетическую активность штамма-продуцента. Если первая - это очищенные продукты химической и пище­вой промышленности, то вторая — в основном те же химические соедине­ния, но не очищенные, а присутствующие в отходах пищевых произ­водств, сельского хозяйства, например глюкоза, гидрол, сахароза в мелас­се, аминокислоты в кукурузном экстракте или в белковых гидролизатах разного происхождения и т.д. У таких источников сырья есть только два преимущества. Это относительно низкая цена и наличие в составе росто­вых факторов, например витаминов, необходимых для нормального разви­тия штамма-продуцента и др. соединений, влияющих на рост и активность производственной культуры. В остальном им присущи только недостатки. Выпускаемые в жидком виде, они обсеменяются посторонней микрофло­рой, что требует сокращения времени их доставки и хранения. Наличие в них воды (не менее 50%) ведет к увеличению транспортных затрат. В су­хом виде - это, как правило, гигроскопичные продукты, требующие соответствующей упаковки и соответствующих условий их хранения на скла­де. При поступлении на биотехнологическое производство они подлежат обязательному для сырья входному контролю не только согласно паспорту (сертификату) изготовителя, но и микробиологическому и биохимическо­му контролю потребителем. Однако низкая стоимость таких источников сырья по-прежнему привлекает внимание многих потребителей. Здесь также не следует забывать и о том, что отказ от их использования в сельском хозяйстве может привести к ослож­нению экологической обстановки в регионах, где эти отходы образуются.

Сырье для процессов ферментации прежде всего решает про­блему формирования питательных сред, в которых должны содер­жаться необходимые элементы для построения биомассы микро­организмов; среда является также средой обитания микроорганиз­мов.

Мы уже касались вопросов элементного состава биомассы микроорганизмов, главным образом основных элементов, составляю­щих до 95—96% сухой массы клеток. Это углерод (50%), водород (8%), кислород (20%), азот (14%), фосфор (3%) и сера (1%).

Кроме того, в клетках содержится 3—4% макроэлементов — та­ких, как калий (до 1%), натрий (до 1%), кальций (до 0,5%), маг­ний (до 0,5%) и железо (до 0,2%). Их содержание в биомассе срав­нительно велико.

Микроэлементы входят в биомассу в следовых количествах (в целом до 0,3%), в том числе марганец, кобальт, медь, молибден, цинк, бор и др. Повышенные концентрации этих элементов ока­зывают ингибирующее действие на развитие микроорганизмов, но без их микродоз обойтись нельзя.

Витамины требуются для развития многих микроорганизмов ауксогетеротрофов — неспособных синтезировать их самостоя­тельно. Чаще всего необходим комплекс витаминов группы В — тиамин, никотиновая кислота, пантотеновая кислота, пиридоксин, инозит и биотин (последнего недостает чаще всего). Но ко­личество витаминов требуется довольно малое (тысячные доли миллиграмма в литре среды), они могут находиться в натуральном сырье.

Потребности микроорганизмов в питании разнообразны, они идут от физиологии и являются основой рецептуры сред. Универ­сальных сред нет.

По физическому состоянию среды могут быть твердые (агар-агар, желатин и т. д.), жидкие и сыпучие (увлажнен­ные отруби, зерно, солома, опилки).

По составу среды могут быть натуральными или синте­тическими. Натуральные среды включают в себя продукты живот­ного или растительного происхождения, сложные и непостоянные по составу. Синтетические среды составляются из определенных химических соединений, обычно из небольшого числа веществ. Они более дороги и менее продуктивны. В них-то и необходимо вносить макро- и микроэлементы, а также витамины.

Сырье представляет собой имеющиеся в распоряжении конк­ретные вещества, чистые или комплексные, которые содержат не­обходимые питательные компоненты. Они должны быть доступ­ными и не очень дорогими и не содержать вредных примесей. По­этому на каждый вид используемого сырья (в том числе и нату­рального) должны быть стандарты, определяющие его качество.

Вода — по массе самый значительный вид сырья, хотя и самый дешевый. Например, на 1 т пекарских дрожжей при производстве расходуется 150—180 м³ воды. Многие виды продуктов биотехно­логии определяются качеством воды (взять хотя бы пиво, вино). Рассмотрим основные требования к этому виду сырья.

Вода должна быть биологически чистой (не более 100 микроор­ганизмов в 1 мл воды), бесцветной, без привкуса и запаха, не дол­жна давать осадка. Сухой остаток воды после выпаривания — не более 1 г/л, общая жесткость — не более 7 мг-экв/л. Слишком же­сткая вода неблагоприятно влияет на процессы ферментации. По содержанию вредных примесей введены следующие ограничения:

- свинец — до 0,1 мг/л;

- мышьяк — до 0,05 мг/л;

- фтор — до 1,5 мг/л;

- цинк — до 5,0 мг/л;

- медь — до 3,0 мг/л.

Источники углеродного питания.Углеводы — наиболее часто используемые в процессах фермен­тации вещества. Рассмотрим соединения, которые относятся к ним.

Глюкоза С₆Н₁₂О₆; влажность —до 9%, зола —до 0,07%, в том числе железо — не более 0,004%.

Сахароза С₁₂Н₂₂О₁₁; влажность — до 0,15%, зола — до 0,03%.

Лактоза С₁₂Н₂₂О₁₁ (получается из молочной сыворотки); лак­тоза — 92%, влажность — до 3%, зола — до 2%, белок — около 3%, молочная кислота — до 1%.

Крахмал (СН₂О)_n; в зависимости от сорта зола 0,35—1,2%.

Гидрол — отход крахмало-паточного производства. Представля­ет собой густой темный сироп с запахом. Содержит до 50% углево­дов, в основном глюкозу, а также органические кислоты. Часть сахаров не сбраживается. Зольность — до 6%.

Меласса — отход производства сахара (упаренная маточная жидкость после отделения кристаллов сахара). Имеет темно-ко­ричневый цвет, плотность 1,35—1,4 г/мл. Содержит 40—55% саха­розы, 0,5—2% инвертного сахара. Имеется 1,1 — 1,5% азота, при­чем третья часть его — в форме бетаина, который микроорганизмами не используется. Содержит также аминокислоты и витами­ны группы В (биотин — до 80 мг/т). В золе много калия, магния, кальция, железа, но мало фосфора. Меласса — продукт сезонный.

При хранении могут быть потери сахаров в результате деятельнос­ти микроорганизмов.

Кукурузная мука содержит 67—70% крахмала, 10% других угле­водов, около 12% белков. Влажность —до 15%, зола —до 0,9%. В золе есть много фосфора, калия, магния.

Пшеничные отруби — отход мукомольного производства, ис­пользуются в твердофазной ферментации. Содержат 16—20% крахмала, 10—12% белков, 10% клетчатки, 3—4% жиров.

Молочная сыворотка (творожная, подсырная). Содержит до 4— 4,7% лактозы, 0,5—1,0% белков, 0,2—0,3% жиров, органические кислоты.

Недостаток — нестабильность при хранении, которого в значительной степени лишены сухая и сгущенная сыворотки.

Свекловичный жом — отход сахарного производства, содержит пектины и целлюлозу — до 22% и до 65% «безэкстрактивных ве­ществ», белки — до 9%.

Гидролизаты древесины. Сама древесина является не очень «вкусным» сырьем для микроорганизмов, но после предваритель­ной обработки — высокотемпературного кислотного гидролиза превращается в гидролизаты. Целлюлоза и пентозаны гидролизуются до глюкозы и других сахаров. Содержание сахаров зависит от породы древесины и технологии гидролиза и составляет 4—8%. Кроме древесины можно использовать для тех же целей различ­ные целлюлозосодержащие сельскохозяйственные отходы (соло­му, кукурузные кочерыжки, стебли хлопчатника и т.п.).

Сульфитные щелока — отход целлюлозно-бумажного производ­ства, продукт гидролиза лигнина и гемицеллюлозы, содержит сбраживаемые сахара (до 3,5%).

Гидролизаты торфа — получают после кислотного гидролиза торфа, который содержит полисахариды до 50% от их содержания в древесине. Упаренный гидролизат имеет 25—30% редуцирую­щих веществ, а также азот и фосфор в доступной для микроорга­низмов форме.

Сок растений (коричневый сок) —до 2% сахаров.

Отходы спиртового производства (картофельная или зерновая барда — содержат от 2,0 до 2,9% редуцирующих веществ).

Картофельный сок — содержит до 1% углеводов (крахмала).

Неуглеводные источники углерода. Углеводороды жидкие — парафины с длиной углеродной цепи С₁₀—С_27. Используются в производстве кормовых дрожжей, ли­монной кислоты, биопрепаратов — деструкторов нефти.

Углеводородные газы — метан, этан, пропан, бутан — применя­лись для получения кормового белка и некоторых продуктов пере­работки биомассы (в том числе феромонов).

Спирты. Этанол используется для выращивания кормовых дрожжей, производства уксусной кислоты и многих других био­продуктов.

Метиловый спирт, хотя и является ядом для человека, очень подходит для культивирования многих видов микроорга­низмов — кормового белка и продуктов их переработки (напри­мер, убихинонов — средств для лечения сердечно-сосудистых за­болеваний).

Уксусная кислота — (синтетическая) иногда используется как источник углерода при получении аминокислот микробиологи­ческим синтезом.

Жиры и масла. В историческом аспекте жиры и масла сначала применяли как средство для предотвращения пенообразования в процессах ферментации.

Например, в производстве тетрациклина долгое время исполь­зовали кашалотовый жир, пока международная конвенция не на­ложила запрет на промысел кашалотов и китов. Для предотвраще­ния вспениваемости стали применять синтетические поверхност­но-активные вещества — пеногасители. Тогда и выяснилось, что кашалотовый жир был нужен продуценту тетрациклина и как ис­точник углеродного питания.

Пришлось заменять его свиным жиром (лярдом), растительны­ми маслами. Говяжий и бараний жир, а также пальмовое масло использовать более трудно, так как они при обычной температуре являются твердыми продуктами.

Среди растительных масел в процессах ферментации применя­ют подсолнечное, соевое, арахисовое, льняное, рапсовое, касторо­вое, кокосовое масла, иногда даже масло бобов какао.

Надо отметить, что излишнее употребление жиров приводит к трудностям на стадиях выделения и очистки продукта.

Экзотические углеродные субстраты. Довольно медленно ис­пользуется микроорганизмами лигнин — отход гидролизного про­изводства.

В лабораторной практике часто применяют агаризованные сре­ды — на основе агара — полисахарида из морских водорослей.

Хитин— покрытие насекомых и морских моллюсков, некото­рых грибов — пока без больших успехов пытаются использовать как углеродный компонент питательных сред. Еще меньшие ре­зультаты дает использование каменного угля и сланцев (конечно, с предварительной термохимической обработкой).

Источники азотного питания.Многие микроорганизмы способны утилизировать источники неорганического азота:

- сульфат аммония (чаще всего);

- нитрат аммония;

- карбамид;

- аммиачная вода (используемая одновременно как источник азотного питания и как титрант для поддержания заданной вели­чины рН).

Часто для процессов ферментации в состав среды требуется включать источники органического азота, действующим началом которых являются аминокислоты и белки. Сырьем при этом могут быть различные натуральные продукты растительного и животно­го происхождения. Рассмотрим наиболее распространенные из этих продуктов.

Кукурузный экстракт — отход крахмало-паточного производ­ства, получающийся путем упаривания жидкости от замачивания («настоя») кукурузных зерен («замочная жидкость») с содержанием сухих веществ не ниже 48%. В процессе замачивания происходит ферментативный гидролиз белков кукурузы, вследствие чего около половины азотсодержащих веществ экстракта представляет собой смесь аминокислот, полипептидов и белков. Экстракт — темная вязкая жидкость, содержит 6,4—8% общего азота, не более 24% золы. В золу входят фосфор, калий, магний, причем фосфор — до 5%, частично в связанном состоянии в виде фитина. Имеются также витамины группы В (биотин), ростовые вещества и биостимулято­ры. Таким образом, кукурузный экстракт представляет собой хоро­шую смесь различных источников питания, что предопределило его использование во многих рецептурах сред.

Традиционно кукурузный экстракт используется при биосин­тезе пенициллина. И хотя его применение имеет недостатки (на­пример, темный пигмент сохраняется на стадиях очистки и его приходится сорбировать в дальнейшем активированным углем), попытки замены этого источника питания другими обычно при­водят к снижению продуктивности процесса ферментации.

Соевая мука получается при размалывании соевого зерна, а так­же соевого жмыха и шрота, образующихся после извлечения соево­го масла. В зависимости от этого получается обезжиренная, необезжиренная и полуобезжиренная мука. Бывает еще дезодорированная (обработанная паром) соевая мука, что позволяет ей храниться в те­чение года. В недезодорированной муке сохраняются ферменты, в связи с чем срок хранения ее не превышает 1,5—3 месяца.

В соевой муке содержится до 45% протеина и 32% углеводов, так что ее можно использовать и как источник углерода. В состав ее золы (4,5—6,5%) входит калий, кальций и магний, а также до­вольно много фосфора.

Соевая мука наряду с кукурузным экстрактом является прекрас­ным источником азотного, углеродного и фосфорного питания.

Недостаток соевых сред — сильная вспениваемость и некото­рые трудности выделения продукта из-за наличия твердого осадка.

Выпускают продукт в сельскохозяйственном секторе, где еще не очень налажена культура производства. Например, качество со­евой муки в ГОСТе определялось по такому показателю, как «хруст на зубах при разжевывании» (в случае, когда в муке имеют­ся механические примеси — песок и т. п.).

Мука семян хлопка содержит 41% протеина и до 29% углеводов. На ее основе путем определенной переработки готовится среда с фирменным названием «Фарма-медиа», имеющая до 59% белков и 24% углеводов. Эта среда используется на Западе для получения многих антибиотиков.

Мука семян льна содержит 36% протеинов и 38% углеводов.

Арахисовая мука — 45% протеина, 5% жира и 23% углеводов.

Рыбная мука содержит до 65% белков и в некоторых случаях используется в качестве компонента сред.

Кровяная мука является чемпионом по содержанию белка — до 80%.

Мясокостная мука содержит до 50% белков.

Сухое молоко обезжиренное содержит лишь 34% белка. Тем не менее молочные белки (казеин, сывороточные белки) в виде гид-ролизатов часто используются как компоненты питательных сред.

Продукты переработки животного сырья — желатин, белкозин — также содержат органический азот, приемлемый для ис­пользования в качестве компонента сред.

Дрожжевые автолизаты, ферментолизаты, гидролизаты в высу­шенном виде содержат до 52% органического азота, в основном в виде смеси аминокислот.

Мясной и рыбный пептоны используются для лабораторных пи­тательных сред. Полная аналогия супа, бульона или студня. К тому же используются довольно качественные пищевые продукты.

Другие виды сырья. Источники фосфорного питания. Часто упоминавшиеся ранее источники органического азота (например, кукурузный экстракт, соевая мука) являются одновременно и источниками фосфора.

Неорганические источники также содержат азот. Это — аммо­фос (смесь моно-, ди- и триаммонийфосфата), отдельно МАФ (моноаммонийфосфат) и ДАФ (диаммонийфосфат).

Иногда применяют ортофосфорную кислоту, но обычно это наиболее дорогой источник фосфорного питания.

Макро- и микроэлементы. Используются в основном неоргани­ческие соли:

- Карбонат калия - К₂СО₃;

- Сульфат калия - K₂SO₄;

- Хлорид калия – KCI;

- Сульфат магния - MgSО₄;

- Сульфат марганца - MnSО₄;

- Сульфат железа - FeSО₄;

- Железный купорос - FeSО₄ х 7Н₂О;

- Сульфат цинка - ZnSО₄;

- Цинковый купорос - ZnSО₄ х 7 Н₂О;

- Сульфат меди - CuSО₄;

- Медный купорос - CuSО₄ х 7 Н₂О;

- Сульфат кобальта - CoSО_4.

Титранты для корректировки рН. Мел позволяет стабилизиро­вать величину рН без добавления других титрантов. Обычно ис­пользуют мел химически осажденный, а не природный, особенно в фармацевтической биотехнологии. В качестве титрантов приме­няют также кислоты и щелочи.

Пеногасители. Используются различные виды жиров, олеино­вая кислота, различные модификации поверхностно-активных ве­ществ: пропинол, лапрол и др.

Выбор сырья для конкретных процессов ферментации.Прежде всего при выборе учитывают эффективность того или иного источника питания, которую проверяют экспериментально при подборе сред. Подбор сред до настоящего времени остается не только наукой, но и искусством.

И, конечно, при выборе сырья учитывается стоимость различ­ных его видов. В качестве примера можно привести сопоставление стоимости различных углеродных источников питания (табл. 3.1).

Таблица 3.1 – Сравнительная стоимость углеродных источников питания