Получение иммунных антисывороток

Адъюванты - это соединения, которые при введении в организм вызывают неспецифическое усиление иммунного ответа и тем самым повышают способность организма реагировать на любой иммуноген. Адъювантными свойствами обладают масла, липосомы, клетки бактерий, полимеры и др. Адъюванты, введенные в организм вместе симмуногеном, выполняют две функции. Во-первых, они способствуют более медленному освобождению иммуногена из участков инъекции, что замедляет его поступление в кровоток, в результате чего увеличивается вероятность встречи иммуногена с иммунокомпетентными клетками, а также резко снижается его токсичность. Во-вторых, адъюванты вызывают сильное воспаление в месте введения иммуногена, при этом активируется фагоцитоз и стимулируется местная циркуляция лимфоцитов, происходит неспецифическая стимуляция иммунокомпетентных клеток. Для усиления такой неспецифической иммуностимуляции в состав адъюваитов дополнительно включают препарат бактериальных клеток рода Bacillus pertussium.

В настоящее время для целей иммунизации широко применяется коммерческий препарат полного адъюванта Фрейнда, в состав которого входят смесь минеральных масел, эмульгатор и убитые микобактерии. Препарат адъюванта можно приготовить в лабораторных условиях, тщательно смешав три части минерального масла, одну часть безводного ланолина, четыре части 0,15 M К-фосфатного буфера и препарат микобактерии до конечной концентрации 10 мг/мл так, чтобы частички микобактерии равномерно распределились по всему объему. Адъювант смешивают с водным раствором иммуногена в отношении 2: 1 до образования нерасслаивающейся эмульсии, в которой водный раствор иммуногена находится в мицеллах.

Использование в иммунизации адъюванта снижает возможность появления толерантности, позволяет расширить диапазон вводимого иммуногена от 50 до 200 мкг на одну инъекцию. После введения адъюванта у животных часто образуются гранулемы, которые влияют на самочувствие животных, поэтому в течение иммунизации необходимо тщательно наблюдать за состоянием здоровья животного. В случае ухудшения самочувствия очередную инъекцию пропускают и лишь после выздоровления животного продолжают иммунизацию.

Способы иммунизации. Введение иммуногена приводит к активации лимфоидных клеток, расположенных вблизи от места инъекции. Наиболее эффективно вводить иммуноген малыми порциями в большое количество точек. Введение иммуногена можно осуществлять различными способами.

Внутрикожное введение. На очищенном от шерсти участке кожи животного делают острым скальпелем несколько царапин, а затем втирают в это место раствор иммуногена. Применение этого способа позволяет получать высокий иммунный ответ уже после однократного введения, в результате чего значительно сокращается расход иммуногена. Однако описанный способ трудоемок в исполнении и обычно вызывает сильные болевые ощущения у животного от обширных участков изъязвлений в местах введения иммуногена.

Подкожная иммунизация. В точки, расположенные вдоль позвоночника животного, вводят 5-6 порций раствора иммуногена объемом приблизительно 2 мл.

Внутримышечное введение. Одновременно часть иммуногена вводят в мышцу задних ног животного и небольшими порциями.

Внутрибрюшинное введение. Этот способ используют для иммунизации мелких лабораторных животных, таких, как мыши или морские свинки.

Прямое введение иммуногена в лимфатические узлы. Иммуноген инъецируют в лимфоидные узлы, расположенные в подколенной ямке задних ног кролика, что позволяет уменьшить его количество до 10-50 мкг, а объем вводимого раствора - до 25 мкл. Этот способ является сложным в техническом исполнении, поскольку включает в себя разрез кожи, поиск лимфоузла и введение иммуногена без его повреждения.

Внутривенное введение. Этот способ обычно применяется для повторных инъекций, после которых проводят отбор крови у животного. Раствор иммуногена вводят непосредственно в кровоток. Адъювант в этом способе введения антигена не применяется, поскольку он оказывает токсический эффект и животное может погибнуть.

Более редко используются такие способы иммунизации, как введение иммуногена в подушечки лап или в конъюнктиву глаза, которые вызывают сильные болевые ощущения у животного. Иммунизацию начинают введением животному иммуногена в смеси с полным адъювантом Фрейнда, а для повторных инъекций применяют неполный адъювант Фрейнда. Перед отбором крови за 7 - 9 дней проводят 1-3 внутривенных инъекций для повышения уровня антител. Число инъекций и интервалы между ними чаще всего подбираются экспериментально для конкретного иммуногена.

В процессе иммунизации у животных отбирают небольшие пробы крови для оценки количества антител. Максимальный уровень иммунного ответа на введение большинства растворимых антигенов достигается через 40-60 дней после первой инъекции. В том случае, когда иммуногеном являются клетки микроорганизмов, максимально высокий уровень антител наблюдается гораздо раньше. После окончания первого цикла иммунизации животному в течение 30 дней дают восстановить здоровье и проводят реиммунизацию, включающую 1-3 внутривенные инъекции. Ниже приводятся схемы иммунизации морских свинок и кроликов инсулином и конъюгатом тироксин - бычий сывороточный альбумин.

Для получения антисывороток морских свинок к инсулину свиньи проводят многоточечные инъекции инсулина подкожно, внутримышечно и внутрибрюшинно по следующей схеме: 1, 8, 15-й день - 200 мкг инсулина в 0,5 мл физиологического раствора смешивают с 0,5 мл полного адъюваита Фрейнда и вводят животному. После 30 дней отдыха животному в течение 3 дней ежедневно вводят антиген путем многоточечных инъекций по схеме: 45, 46, 47-й день - 150 мкг инсулина в 0,7 мл физиологического раствора. Отбор крови проводят через 7-9 дней из сердца.

Второй цикл иммунизации осуществляется после месячного отдыха животных по схемам 45, 46 и 47 дней.

Для получения антисывороток с титром, удовлетворительным для проведения ИФА, часто требуется 4-5-кратное повторение циклов иммунизации. Отбор крови каждый раз проводится на 7 - 9-й день после последней инъекции.

Иммунизацию кроликов конъюгатом тироксин - БСА проводят многоточечными инъекциями вдоль позвоночника и внутримышечно в область микроузлов задних лап по следующей схеме: 1-й день - 1-2 мг конъюгата.

T4 - БСА в 0,7 мл физиологического раствора смешивают с 0,7 мл адъюванта Фрейнда и полученную эмульсию вводят животному; 31, 32, 33 или 45, 46, 47-й дни - внутривенно вводят 0,7-1 мл физиологического раствора, содержащего 1-2 мг T4 - БСА.

Кровь берут из сердца на 7-9-й день после последней инъекции. Через месяц цикл внутривенной иммунизации, повторяют.

Отбор крови и получение антисыворотки. Иммунизированное животное используется в качестве донора иммунной сыворотки в течение 5-7 мес, за это время удается провести 5-6 циклов иммунизации. Животных, прошедших несколько циклов иммунизации, называют гипериммунными. Кровь у животных отбирают из вены уха или непосредственно из сердца путем кардиальной пункции в объеме 50-70 мл у кролика и 5-10 мл у морской свинки в стерильные пробирки, промытые стерильным буферным раствором.

Кровь, лишенная клеточных элементов, называется плазмой. В плазме содержится фибриноген, приводящий к образованию во всем объеме пробирки сгустка фибрина, который осторожно удаляется центрифугированием при 1000-2000 об/мин в течение 15 мин. Плазма, лишенная фибрина, называется сывороткой. Для удаления белков системы комплемента сыворотку прогревают в течение 30 мин при 56°С, при этом антитела сохраняют свою активность. Обработку крови и получение сыворотки надо проводить с максимальной осторожностью, избегая разрушения эритроцитов. Наличие внутриклеточных белков и ферментов в сыворотке может приводить к появлению дополнительного фона в некоторых модификациях иммуноферментного анализа. Это замечание касается прежде всего использования антисывороток в гомогенных методах.

Хранение антисывороток. Нативную иммунную сыворотку можно хранить 3-6 мес без потери иммунологической активности в замороженном состоянии при - 20°С, предварительно разливая ее во флаконы по 0,5-1 мл. Отмораживание-замораживание ведет к снижению иммунологической активности сыворотки, поэтому лучше замораживать ее небольшими порциями для одноразового употребления.

Удобно хранить антисыворотку в лиофилизованном состоянии в ампулах под вакуумом. В сухом виде антисыворотка сохраняет иммунологическую активность при комнатной температуре в течение 1-2 лет.

Размороженную или разведенную сухую сыворотку в растворе можно хранить при +4°С в течение недели, предварительно добавив в нее консервант - хлороформ, 0,1% азида натрия или 0,01% мертнолата. Следует иметь в виду, что консерванты могут быть ингибиторами ферментов-маркеров в иммуно-феремнтном анализе.