Помещения, оборудование и инструменты для работ по культуре клеток растений

Методические основы культивирования органов, тканей, клеток и протопластов растений in vitro

Для получения культуры клеток in vitro небольшой фрагмент тканей растений (эксплантат) помещают в культуральный сосуд (пробирку, колбу и др.) на искусственную питательную среду, на которой клетки эксплантата начинают делиться, образуя каллюс. Каллюсная культура – наиболее обычный и распространенный вариант культуры клеток растений in vitro. Ее получают из эксплантатов при их культивировании на поверхности полутвердых (чаще всего агаризованных) питательных сред. При культивировании клеток в погруженном состоянии в жидких питательных средах получают суспензии клеток растений (суспензионные культуры). Использование ферментных растворов, растворяющих клеточные стенки, дает возможность получить протопласты – клетки растений, лишенные целлюлозной оболочки. Протопласты можно культивировать на жидких питательных средах или высевать суспензию протопластов на поверхность агаризованной питательной среды. Со временем протопласты восстанавливают клеточную стенку и переходят к делению, образуя каллюсную ткань. При определенных условиях каллюсные культуры, суспензии клеток способны к морфогенезу и/или соматическому эмбриогенезу, что дает возможность получать растения-регенеранты. Растения-регенеранты могут также быть получены непосредственно из эксплантатов. Их можно выращивать длительное время и размножать в культуре in vitro (культура пробирочных растений).

Работы по получению и поддержанию всех названных или отдельных видов культуры органов, тканей, клеток и протопластов растений (далее – культуры клеток растений) требуют специальных помещений, оборудования, инструментов, предполагают использование сложных питательных сред. Помещения, инструменты, лабораторная посуда и питательные среды подвергаются стерилизации с помощью различных методов. Многие работы проводятся с соблюдением правил асептики.

Помещения, оборудование и инструменты для работ по культуре клеток растений

Для проведения работ по культуре клеток растений требуются лабораторные комнаты для мытья и стерилизации посуды и инструментов, для приготовления и стерилизации питательных сред, для цитологических исследований, для получения, пассирования и других манипуляций с клеточными культурами, для культивирования клеток растений, боксовая или грунтовая теплица с искусственным освещением.

В комнате для мытья посуды, как правило, имеется аквадистиллятор (аквабидистиллятор). Дистиллированная вода необходима для приготовления питательных сред, поласкания вымытой посуды, эксплантатов после их обработки стерилизующими агентами. Вымытую посуду просушивают в суховоздушном шкафу при 80-100⁰ С. Высокая температура также обеспечивает ее стерилизацию.

Для работ по культуре клеток растений используют посуду стеклянную химическую различного типа и объема для приготовления питательных сред и хранения запасных растворов, получения и манипуляций с культурами (вычления и стерилизации эксплантатов, пассирования культур, черенкования пробирочных растений и др.), для культивирования: колбы, стаканы, чашки Петри, пробирки, мензурки, мерные цилиндры, пипетки. В последнее время широкое применение нашла разнообразная пластиковая посуда для культуры клеток растений разового использования. Однако во многих случаях удобнее и дешевле использовать стеклянную посуду.

В комнате для мытья посуды нередко размещают автоклавы, которые необходимы для стерилизации питательных сред и посуды, а также отдельный суховоздушный шкаф для стерилизации инструмента. Инструменты стерилизуют при 160^оС в течение 4 час, помещая их в металлические пеналы. Минимальный набор инструментов включает: пинцеты разной длины с тупыми и острыми концами, скальпели, ножницы и щипцы медицинские. В процессе работы инструменты размещают на специальном штативе или стерилизованных чашках Петри, после каждой операции их погружают в 96% спирт и прожигают в пламени спиртовки, затем охлаждают (Рис. 2.1)

В комнате для приготовления питательных сред должны быть различные весы, лабораторный рН-метр, электроплита и водяная баня для приготовления агаризованных питательных сред (для небольших объемов можно использовать микроволновую печь), холодильник, морозильник, магнитная мешалка, вытяжной шкаф. В этой же комнате, или отдельном помещении, могут располагаться микроскопы (обычные и/или инвертированные), бинокулярные лупы, счетчики клеток и другое оборудование и инструменты, необходимые для цитологических исследований, манипуляций с протопластами.

Все работы, непосредственно связанные с культурой клеток растений (вычленение и стерилизация эксплантатов, пассирование культур, черенкование пробирочных растений и др.), проводят в ламинар-боксах, которые размещают в отдельном помещении или в комнате для приготовления питательных сред, проведения цитологических исследований (Рис. 2.2). Ламинар-бокс (камера обеспыливания) представляет собой стол с поверхностью из нержавеющей стали, изолированный от окружающей среды сверху, сзади, слева и справа. В рабочее пространство ламинар-бокса (над столом) поступает под давлением стерильный воздух, что обеспечивает условия асептики, необходимые для работ по культуре клеток растений. Воздух засасывается в ламинар-бокс из помещения с помощью специального насоса и пропускается через фильтры грубой и тонкой очистки, которые задерживают не только частицы пыли, но и клетки микроорганизмов. Различают ламинар-боксы горизонтальные и вертикальные (в зависимости от направления движения стерильного воздуха в рабочем пространстве), в равной степени эффективные. Перед началом работы поверхность стола ламинар-бокса обеззараживают с помощью бактерицидной УФ-лампы, встроенной над поверхностью стола (в течение 30 мин - 1час), затем стол протирают 70% раствором этилового спирта.

В качестве культуральной комнаты обычно используют изолированное помещение, оборудованное кондиционером. В нем размещают термостаты (культивирование клеток растений в темноте). Однако во многих случаях при культивировании клеток растений требуется освещение. Для этого, в простейшем случае, в культуральной комнате размещают стеллажи с лампами дневного света (Рис. 2.3). Лампы могут располагаться сверху над полками или по центру между двумя полками (культуры освещаются в этом случае в основном сбоку). Лампы включаются и выключаются автоматически в определенное время. Для культивирования клеток растений могут использоваться также различные климатические камеры с регулируемым режимом освещения, температуры и влажности.

Для работ по культуре клеток растений необходима боксовая или грунтовая теплица с искусственным освещением. Во-первых, в ней могут выращиваться растения, с которых берут эксплантаты. Эксплантаты, полученные с таких растений, как правило, менее инфицированы, чем от растений, выращиваемых в поле. Кроме того, успех культивирования клеток растений и получения растений-регенерантов в некоторых случаях в значительной степени зависит от условий выращивания (температура, режим и способ освещения) растений-доноров эксплантатов (например, при получении гаплоидов в культуре пыльников). Во-вторых, теплица необходима для высадки в грунт полученных растений-регенерантов, так как их перенос в условия in vivo из пробирок требует специальной адаптации.

Питательные среды

В процессе развития методов культуры клеток растений происходило постоянное совершенствование питательных сред. В настоящее время существует большое количество питательных сред для разных задач культивирования, видов растений и типов эксплантатов. Основываясь на данных литературы, можно подобрать приемлемый вариант практически для любого вида работ. В отдельных случаях требуется оптимизация питательной среды. Для этих целей разработаны специальные подходы, в том числе основанные на использовании методов математического планирования эксперимента. Варьируя, по определенной схеме, концентрации отдельных компонентов питательной среды (прежде всего, регуляторов роста), находят оптимальный вариант.

Существует ряд базовых питательных сред, которые берут за основу, а затем производят, если требуется, их оптимизацию. Наиболее часто используется среда Мурасиге и Скуга (Murashige, Skoog 1962). Она хорошо сбалансирована по входящим в нее компонентам и дает хорошие результаты при культивировании клеток многих видов растений (Таблица 2.1). Среда B5 Гамборга (Gamborg et al. 1968) больше подходит для злаковых культур, среда Нич (Nitsch, Nitsch 1969) – для культуры пыльников двудольных растений. Однако различные питательные среды для культуры клеток растений имеют много общего. Они должны включать все необходимые минеральные и органические элементы в концентрациях, максимально приближенным к тем, которые получают интактные растения для нормального роста и развития в условиях in vivo.

Минеральные элементы. Для обеспечения полноценного метаболизма клеток в культуре in vitro в питательных средах должен присутствовать ряд макро- и микроэлементов неорганического происхождения. В соответствии с рекомендациями Международной ассоциации физиологов растений те элементы минерального питания растений, которые требуются в концентрациях, превышающих 0,5 мМ, относят к макроэлементам, а те, что необходимы в более низких концентрациях – к микроэлементам. Основные макроэлементы питательных сред для культуры клеток растений: азот,калий,фосфор, кальций, магний и сера. Они представлены в питательных средах в виде соответствующих солей, которые хорошо усваиваются растительными клетками. Важно отметить, что азот присутствует в питательных средах в нитратной и аммонийной форме. Их соотношение во многих случаях имеет большое значение. В качестве дополнительного источника азота в состав сред в некоторых случаях добавляют аминокислоты (аланин, глутаминовую кислоту, глицин, аргинин, аспарагиновую кислоту, пролин и др.). Иногда смесь аминокислот заменяют гидролизатом казеина.

Основные микроэлементы питательных сред: железо (двухвалентное), марганец, бор, медь, цинк, йод, молибден, кобальт. Наиболее важными микроэлементами являются железо и медь, потому что они участвуют в регуляторных процессах и окислительно-восстановительных превращениях, входят в состав коферментов. Железо используется в виде хелатов [FeSО₄ + ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота или её динатриевая соль Na₂ ЭДТА, трилон Б)].

Углеводыявляются необходимым компонентом питательных сред для культуры клеток растений, так как в большинстве случаев последние не способны к автотрофному питанию. При изолировании эксплантатов из хлорофиллоносных тканей и помещении их на питательную среду они, как правило, теряют хлорофилл. При культивировании на свету одни культуры остаются лишенными хлорофилла, другие - зеленеют, но не способны обеспечивать себя полностью углеводами за счет фотосинтеза. Кроме того, углеводы в питательной среде выполняют осмотические функции, особенно в случае культуры протопластов.

Чаще всего углеводным компонентом в составе питательных сред для культуры клеток растений является сахароза в концентрации 2-3 %. Для культуры пыльников применяют более высокие концентрации – 6-10%. Помимо сахарозы в качестве источника углеродного питания берут глюкозу, фруктозу, галактозу, мальтозу и др. Основной осмотик для культуры протопластов - маннитол (13%). Также применяют для этих целей сорбитол, глюкозу, сахарозу, сочетание различных сахаров.

Витаминыотносятся к веществам, играющим существенную роль в культуре клеток растений. Большая часть витаминов входит в состав ферментов, катализирующих метаболически важные реакции. В состав питательных сред чаще всего включают водорастворимые витамины: тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту, а также рибофлавин, биотин, пантотеновую кислоту, аскорбиновую кислоту. Во многих питательных средах для культуры клеток растений присутствует миоинозит (мезо-инозит), который в растениях участвует в обмене ауксина. В культуре клеток мезоинозит играет важную роль в биосинтезе пектина и гемицеллюлозы, участвует в утилизации ионов.

Действие витаминов на рост культуры клеток зависит от способности клеток синтезировать их в оптимальном или субоптимальном количестве и от состава других компонентов питательной смеси, с которыми витамины могут взаимодействовать синергически (например, с цитокининами) или антагонистически. При внесении полной смеси витаминов стимулирующее действие может определяться синергизмом между отдельными витаминами.

Фитогормоны и регуляторы роста и развития растений. Фитогормоны – синтезируемые растениями натуральные органические соединения, которые оказывают влияние на их рост и развитие. Кроме натуральных фитогормонов, выделенных из растений, имеется достаточно большое количество искусственных соединений, которые обладают аналогичным действием. Их называют регуляторами роста и развития растений (далее - регуляторы роста). В питательные среды в основном добавляют регуляторы роста, поскольку они более дешевые, более стойкие и во многих случаях их активность выше, чем у фитогормонов.

Чаще всего в питательных средах присутствуют различные ауксины и цитокинины. Для определенных целей также используют гиббереллины, абсцизины, этилен, ретарданты.

Природный ауксин в растениях встречается в основном в виде β-индолил-3-уксусной кислоты (гетероауксина) – ИУК. Второй представитель этого класса фитогормонов — фенилуксусная кислота (ФУК), однако ее активность значительно ниже ИУК. Ауксины – это производные аминокислот: ИУК – триптофана, ФУК – фенилаланина. Ауксины в растениях играют важную роль в процессах удлинения стебля, междоузлий, тропизма, апикального доминирования, образования придаточных и боковых корней, луковиц, заложения вегетативных почек и др. В культуре клеток ауксины – обязательные компоненты, необходимые для инициации процессов морфогенеза. Они оказывают влияние на деление, растяжение и дифференциацию клеток.

Избыток ауксина в растениях разрушается ИУК-оксидазой. Для практических целей в сельском хозяйстве, а также для культуры клеток растений часто применяют не ИУК, а синтетические ауксины, так как они не разрушаются ИУК-оксидазой. Молекулы синтетических ауксинов имеют разную структуру, но содержат ароматическое или гетероциклическое кольцо, боковая часть которого представлена остатком алифатической кислоты. Чаще всего в питательных средах в качестве ауксина используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4 Д). Также применяют индолил-3-масляную кислоту (ИМК), α-нафтил-1-уксусную кислоту (НУК), фенилуксусную кислоту (ФУК), 2,4,5 трихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4,5Т), п-хлорфеноксиуксусную кислоту (ПХФК), пиклорам (4-амино3,5,6трихлорпиколиновая кислота) и т.п. По действию на культуру стебля табака активность 2,4Д в 8-12 раз, а 2,4,5Т, ПХФК и пиклорама в 2-4 раза выше, чем у ИУК.

Цитокинины в растениях выполняют функции, связанные с индукцией клеточных делений, модификацией апикального доминирования и дифференциацией стеблей. Они способствуют ветвлению, формированию почек, ускоряют прорастание семян, вызывают прерывание периода покоя спящих почек, семян и клубней. В культуре клеток растений они являются важнейшим фактором индукции митотической активности клеток, а также, взаимодействуя с другими фитогормонами, - в процессах инициации клеточной дифференциации и морфогенеза.

Цитокинины представляют собой N-замещенные производные аденина и синтезируются в растении из двух главных предшественников — мевалоновой кислоты и 5'-АМФ. Возможен синтез цитокининов из продуктов распада некоторых тРНК, содержащих модифицированный аденозин. Показана высокая кининовая активность и у дифенилмочевины и ряда ее производных. Первый цитокинин, который был использован в питательных средах для культуры клеток растений, - кинетин (N⁶-фурфуриламинопурин), выделенный из ДНК спермы сельди Миллером и Скугом в 1955 г. Как отмечалось в 1 главе, открытие кинетина имело революционное значение для культуры клеток растений, поскольку дало возможность управлять процессом регенерации растений из каллюсных и суспензионных культур. Позднее были выделены натуральные фитогормоны с кининовой активностью – зеатин [6-(4гидрокси-3метилтранс-2-бутаниламинопурин] и 6γγ изопентиламинопурин (2iР, ИПА). В настоящее время основным цитокинином, который используют в питательных средах для культуры клеток, является синтетический регулятор роста 6-бензиламинопурин (6-бензиладенин, 6-БАП). Однако в некоторых случаях незаменимыми являются значительно более дорогостоящие зеатин (или зеатин рибозид) и 2iР.

Гиббереллины с точки зрения химического строения - тетрациклические карбоновые кислоты. В растениях они образуются из мевалоновой кислоты, синтезированной из ацетил-КоА. В тканях растений одновременно встречаются несколько гиббереллинов, в процессе онтогенеза их набор и соотношение изменяются. Подобно ауксинам, гиббереллины оказывают множественные действия: стимулируют рост в фазе растяжения и деления клеток (например, камбия), вызывают рост плодов. Рост в фазе растяжения стимулируется одновременно действием гиббереллинов и ауксина. В других случаях гиббереллины могут выступать как антагонисты ауксина, например, задерживать рост придаточных корней. Их используют для прерывания периода покоя семян, луковиц и клубней, усиления роста растений. Подобно ауксинам они способны вызывать партенокарпию (так, их рекомендуют использовать для обработки виноградников с целью увеличения размеров кистей). Известно около 70 гиббереллинов, однако для практических целей наиболее часто применяют гибберелловую кислоту GA3 (ГК 3), которую получают путем микробиологического синтеза. В питательных средах для культуры клеток растений гиббереллины используют для усиления роста апикальных меристем или недоразвитых зиготических зародышей при получении из них растений-регенерантов, усиления роста суспензионных культур при пониженной их плотности и других целей.

Абсцизовая кислота (АБК) обладает множественным физиологическим действием. Хорошо известно действие АБК как ингибитора роста растений, способствующего переходу растений в состояние покоя. Во многих случаях АБК выступает антогонистом ауксинов, цитокининов и гиббереллинов. В питательных средах для культуры клеток растений АБК иногда применяют в сочетании с другими фитогормонами для обеспечения нормального роста и развития соматических эмбриоидов.

Этилен. Все части растений образуют этилен. Особенно этот процесс усиливается при воздействии стрессовых факторов. В культуре клеток растений этилен может оказывать стимулирующий или ингибирующий эффект (в различных системах) на процессы морфогенеза. Для образования этилена с целью воздействия на растения или культуру клеток растений обычно используют химические вещества, выделяющие этот газ при разрушении, например, 2-хлороэтилфосфоновую кислоту (препараты известны под названиями Этрел, Этафон, Кампозан).

Ретарданты– регуляторы роста различной химической природы, подавляющие рост растений. Их применяют в растениеводстве для уменьшения высоты сельскохозяйственных растений, увеличения толщины стебля, что в результате позволяет уменьшить полегание. В биотехнологии использование ретардантов (хлохолинхлорида, алара и др.) может быть полезным для уменьшения длины междоузлий пробирочных растений. Это позволяет удлинить срок между пересадками растений на свежую питательную среду, а также обеспечивает лучшую приживаемость растений при высадке их в грунт.

Органические добавки неопределенного состава. Клетки растений более чувствительны, чем микроорганизмы, к присутствию посторонних ингредиентов, поэтому требуют химически чистых компонентов среды. Вместе с тем, некоторые питательные среды содержат натуральные биологические добавки: жидкий эндосперм кокосового ореха (кокосовое молоко), экстракт эндосперма каштана, гидролизат казеина, солодовый экстракт, томатный сок, дрожжевой экстракт, картофельный отвар и др. Практика использования подобных добавок широко применялась в 30-60 годы предыдущего века, когда технологии культивирования клеток и получения растений-регенерантов для большинства видов растений были разработаны недостаточно. Особенно популярным было использование кокосового молока, чей эффект, как выяснилось позднее, был обусловлен присутствием в нем фитогормона зеатина. Однако в последнее время исследователи предпочитают применять компоненты питательных сред определенного состава и высокой степени очистки, что обеспечивает воспроизводимость результатов. Тем не менее, иногда удается достичь более высокой результативности морфогенеза в культуре клеток благодаря натуральным биологическим добавкам, например, при использовании картофельного отвара для повышения выхода зеленых гаплоидных растений-регенерантов в культуре пыльников пшеницы.

Адсорбенты. Некоторые эксплантанты выделяют в питательную среду вещества, которые могут ингибировать каллюсообразование и привести к остановке роста и гибели культуры. Для их адсорбции в питательные среды добавляют активированный уголь или другие адсорбенты, например, поливинилпирролидон.

Гелирующие агенты. Каллюсные культуры и пробирочные растения в культуре in vitro выращивают на полутвердых (гелеобразных) питательных средах, которые обеспечивают хороший доступ компонетов питательной среды для клеток или растений и не требуют постоянного перемешивания культур для их аэрации, что является обязательным при использовании жидких питательных сред. Для получения гелеобразных питательных сред в них добавляют гелирующие вещества, которые должны отвечать следующим требованиям: они не должны оказывать неблагоприятного влияния на культивируемые клетки растений; свойства питательной среды, в которую добавлен гелирующий агент, не должны существенно меняться при ее автоклавировании и в процессе культивирования клеток. В горячем состоянии питательная среда должна быть жидкой, а при комнатной температуре (температуре культивирования) – иметь полутвердую (гелеобразную) консистенцию.

Чаще всего в качестве гелирующего агента используют агар-агар (агар), который выделяют из красных водорослей, например, Gelidium amansii. Агар представляет собой смесь полисахаридов, производных галактозы: нейтральной полимерной фракции – агарозы, обеспечивающей силу геля, и заряженных анионных полисахаридов – агаропектинов, влияющих на его вязкость. Качество агара зависит от степени его очистки и может варьировать у разных производителей. Поэтому желательно использовать высокоочищенный агар одной из фирм. Концентрация агара в питательной среде -0,6-1,0%. Помимо агара, используют также агарозу (в культуре одиночных клеток, протопластов), гельрит (полисахарид, который получают путем микробного синтеза из Pseudomonas elodea), фитагель и др., состав которых легче поддается контролю.

Ph питательной среды имеет большое значение. Оптимальное ее значение во многом зависит от вида растений, точнее от того, на каких почвах определенные виды растений предпочитают расти в естественных условиях: на кислых, нейтральных или щелочных. Для большинства видов растений pH питательной среды для культуры клеток in vitro 5,5-5.8. Однако эти значения могут быть ниже для растений, произрастающих в естественных условиях на кислых почвах, и выше – для растений, растущих на щелочных почвах.