Приготовление питательных сред

Питательные среды для культуры клеток растений готовят по прописям из необходимых химических компонентов. Рекомендуется использовать реактивы марки ХЧ (химически чистые) или ОСЧ (особо чистые). Реактивы желательно приобретать марки “Plant Cell Culture Tested” (апробированы для культуры клеток растений). При приготовлении растворов используется дистиллированная или бидистиллированная вода.

Ряд ведущих производителей химических реактивов, например SIGMA, MERC, SERVA и др. наладили производство готовых питательных сред для культуры клеток растений и отдельных их компонентов (макро-, микроэлементов, витаминов и т.д.). Использование готовых смесей позволяет значительно упростить процесс приготовления питательных сред, повысить их качество.

В прописях питательных сред концентрации минеральных и органических компонентов обычно выражают в единицах массы на объем (мг/л), для чего в англоязычной литературе иногда используют сокращение «ppm» (1 part per million). Международной ассоциацией физиологии растений рекомендовано для этих целей использовать молярную концентрацию: молекулярная масса вещества, выраженная в граммах (1 моль – 1М), в миллиграммах (1mM), в микрограммах (1μM), на литр раствора. При этом концентрации макроэлементов и органических добавок предлагается выражать в mМ, а микроэлементов, витаминов, регуляторов роста - в μМ. Таким образом, если в прописи питательной среды написано, что она содержит 1 μМ 2,4 Д, то это означает, что в среде содержится 221 μг/л этого регулятора роста. Для перевода концентрации компонента среды, выраженного в мг/л, в концентрацию, выраженную в mМ, используют следующую формулу: количество mМ = количество мг вещества/молекулярная масса вещества.

При приготовлении питательных сред, особенно из отдельных компонентов, а не готовых смесей, удобно пользоваться маточными (запасными) концентрированными растворами. Это не только упрощает работу, но и повышает точность дозировки компонентов среды. Обычно готовят следующие запасные растворы: микроэлементы (отдельно раствор йодистого калия), хлористый кальций, витамины, хелат железа, регуляторы роста.

Приготовление отдельных запасных растворов имеет свои особенности. Так, для приготовления 100 мл запасного раствора микроэлементов в мерную колбу наливают 50 – 60 мл дистиллированной воды, в которую последовательно добавляют предварительно растворенные в небольшом количестве воды соли (в отдельной емкости) в количестве (мг), как они приведены в прописи. Важно соблюдать приведенный в прописи порядок добавления микроэлементов, хорошо их перемешивать. После добавления последнего микроэлемента объем раствора доводят дистиллированной водой.

Для приготовления 100 мл запасного раствора хелата железа берут навески сульфата железа (II) семиводного – 557 мг и Na₂ЭДТА – 745 мг. Каждую из навесок растворяют в горячей дистиллированной воде (на водяной бане) объемом 25 – 30 мл. После полного растворения компонентов, растворы смешивают в мерной колбе и доводят объем раствора дистиллированной водой. Раствор должен иметь довольно яркую желтую окраску, слегка опалесцировать. На 1 л питательной среды обычно добавляют 5 мл такого запасного раствора.

При приготовлении запасных растворов регуляторов роста следует учитывать, что фитогормоны, относящиеся к группе ауксинов (2,4Д, ИУК, НУК, ИМК и др.), а также гиббереллин, являются слабыми органическими кислотами, поэтому их растворение проводят в щелочах. Для их растворения подходит 96% этиловый спирт. Фитогормоны группы цитокининов (6-БАП, зеатин, кинетин и др.), напротив, растворяют в кислотах. Для этой цели подходит 1н соляная кислота. Запасные растворы 6-БАП, зеатина и гиббереллина целесообразно делать из расчета 1 мг/1мл. Так как при хранении в холодильнике концентрированных растворов некоторых ауксинов происходит их кристаллизация, рекомендуется делать их запасные растворы более разбавленными, а именно 0,1мг/1 мл (соответственно, в питательную среду добавляется в десять раз больше запасного раствора).

Все запасные растворы хранят в холодильнике при 4 - 5^оС в химической посуде (флаконах или плоскодонных колбах) с плотно закрывающимися крышками. Для хранения раствора йодистого калия используют флакон из темного стекла. Все флаконы должны быть подписаны в соответствии с содержимым, концентрацией (например, 1 мг/1мл) и указанием даты приготовления раствора. Растворы могут храниться в холодильнике без потери качества до 6 месяцев. При более длительном хранении или появлении инфекции, целесообразно приготовить свежий раствор. Растворы зеатина и гиббереллина используются достаточно редко и их следует хранить при -20^оС. Поэтому эти растворы целесообразно аликвотировать в новые стерилизованные автоклавированием пробирки Эппендорф объемом 1,5 – 2 мл и, упаковав в специально выделенный для них контейнер, хранить в морозильной камере. В таких условиях растворы зеатина и гибеллина могут сохраняться без потери активности более двух лет.

Питательную среду удобно готовить в большом стакане или колбе подходящего объема. Вначале в стакан (колбу) наливают дистиллированную (бидистиллированную) воду на 1/2 требуемого объема, в воду добавляют согласно прописи порошкообразные минеральные компоненты среды (или готовые к применению смеси макро- и микроэлементов), затем компоненты в виде запасных растворов (при использовании готовых смесей макро- и микроэлементов в среду добавляют недостающие элементы согласно прописи). Необходимо добиваться полного растворения каждого вводимого порошкообразного компонента перед введением следующего, для чего можно воспользоваться магнитной мешалкой.

Углеводный компонент вносится последним. Объем раствора доводится до конечного с помощью дистиллированной воды (в мерной колбе). После этого раствор выливают в стакан, в котором доводят рН питательной среды. рН доводят до требуемого значения с помощью 1н NaOH. Растворы щелочи добавляют по каплям в питательную среду, в которую опущены электроды включенного рН-метра. Для перемешивания раствора можно использовать магнитную мешалку. В случае перетитрования раствора среду подкисляют аналогичным образом с помощью 1н соляной кислоты.

Если предполагается использовать полутвердую среду, к ней добавляют навеску агара (или другого гелеобразующего вещества) и тщательно его перемешивают. Растворение агара проводят путем нагревания раствора на водяной бане или при стерилизации среды в автоклаве. Для растворения агара в небольших объемах среды можно использовать микроволновую печь.

Как видно из приведено выше описания питательных сред, они имеют весьма сложный состав. Использование готовых смесей компонентов среды и запасных растворов позволяет упростить процесс приготовления сред. Тем не менее, он требует высокой концентрации внимания работников. Следует также иметь в виду, что в прописях обычно приводятся концентрации отдельных компонентов в расчете на 1 литр конечного объема питательной среды. В реальности нередко приходится готовить и другие объемы. В связи с этим рекомендуется при приготовлении питательной среды использовать так называемый чек-лист, в котором приведены компоненты питательной среды и запасные растворы в порядке их добавления в готовящийся раствор и их количество, которое добавляется в раствор. В процессе приготовления среды после добавки каждого очередного компонента (маточного раствора) в чек-листе делается отметка о добавлении его в раствор. Для каждого конкретного случая (в зависимости от того, какую среду необходимо приготовить и в каком объеме) желательно готовить заранее отдельный чек-лист.

Разлив по культуральным сосудам и стерилизация питательных сред может различаться в зависимости от типа культуры и целей эксперимента. В большинстве случаев для культуры клеток используют стеклянные пробирки, укупоренные изготовленными из ваты пробками, обернутыми марлей. Среды разливают по пробиркам, контейнерам после растворения агара, укупоривают их пробками, затем автоклавируют при 0,8 – 0,9 атм в течение 20 - 30 мин.

В последнее время получили распространение для культуры клеток растений пластиковые пробирки с крышками или контейнеры разового использования. Соответственно, питательную среду в них разливают в асептических условиях (в ламинар-боксе) после автоклавирования. Во многих случаях для культуры клеток используют чашки Петри (стеклянные или разовые пластиковые), в которые также питательную среду разливают после автоклавирования. Наконец, некоторые питательные среды содержат термолабильные компоненты (зеатин, гиббереллин, аскорбиновая кислота и др.), которые разрушаются или теряют активность при автоклавировании. Такие компоненты растворяют в нужном количестве (из расчета на полный объем приготавливаемой питательной среды), стерилизуют в асептических условиях путем фильтрации через бактерицидные фильтры (нейлоновые мембраны с микропорами) и добавляют в проавтоклавированную и охлажденную до 50-60^оС питательную среду. Запасные растворы регуляторов роста, концентрация в питательной среде которых небольшая, можно фильтровать заранее и добавлять их в проавтоклавированную питательную среду в соответствии с прописью с помощью автоматических пипеток, снабженных стерильными носиками.