Условия культивирования. Перенос культур на свежую

Питательную среду

В зависимости от типа эксплантата и целей эксперимента для культуры клеток используют различные культуральные сосуды (стеклянные или пластиковые пробирки, чашки Петри разного размера, колбы и контейнеры) и условия культивирования. Культивирование производят в культуральных комнатах, оборудованных кондиционером. Многие культуры выращивают в темноте в термостатах. Оптимальная температура 24-26^оС. Однако, в зависимости от вида растений, она может быть немного выше или ниже.

Если требуется освещение культур (для поддержания культур пробирочных растений, клонального размножения растений in vitro и др.), в простейшем случае, в культуральной комнате размещают стеллажи с подсветкой лампами дневного света. Лампы включаются и выключаются автоматически в определенное время. Обычно длина светового периода составляет 14-18 час, темнового – 6-10 час. Температура в световой период может быть 22-26^оС, в темновой – несколько ниже, 16-18^оС. Освещенность культур варьирует в достаточно широких пределах (от 1 до 10 тыс. люкс). Для освещения культур чаще всего используют лампы дневного света. Однако могут применяться и другие лампы, в том числе со специфическими спектральными характеристиками.

Температурный и световой режим культивирования, спектральные характеристики света могут оказывать существенное влияние на индукцию процессов морфогенеза в культуре клеток растений. Поэтому для установки различных режимов культивирования целесообразно использовать климатические камеры.

Для культивирования клеточных суспензий в культуральной комнате устанавливают качалки, ротационные установки или более сложные приспособления для перемешивания и аэрации культур (биореакторы).

В процессе культивирования каллюсные клетки стареют (дифференциация каллюсных клеток), теряют способность делиться и постепенно отмирают. Также происходит истощение питательной среды, в нее могут выделяться клеточные метаболиты, которые оказывают неблагоприятное влияние на рост культур. Сама культура может существенно увеличиться в объеме, в результате чего размеры культурального сосуда становятся недостаточными. В связи с этим через определенные промежутки времени небольшой фрагмент каллюса, или объем суспензии (инокулят), переносят в стерильных условиях в приготовленные сосуды со свежей питательной средой (пассирование, субкультивирование). При регулярном пассировании способность к делению каллюсных клеток или клеток в суспензии может поддерживаться в течение десятков лет. Пробирочные растения при субкультивировании черенкуют: на свежую питательную среду переносят небольшой фрагмент растения, например, кусочек стебля с 1-2 пазушными почками, из которого восстанавливается пробирочное растение.

Перенос культур с одной среды на другую применяют также для индукции у них процессов морфогенеза, прежде всего, с целью получения растений-регенерантов. Это обусловлено тем, что питательные среды для пролиферации и морфогенеза клеточных культур, как правило, существенно различаются. Одновременно с пассированием нередко изменяют и условия культивирования (световой и температурный режим).

Заключение

Работы по получению и поддержанию культуры клеток растений требуют специальных помещений, оборудования, инструментов, предполагают использование сложных питательных сред.

Существует большое количество питательных сред для разных задач культивирования, видов растений и типов эксплантатов. Наиболее часто используется среда Мурасиге и Скуга (Murashige, Skoog 1962). Она хорошо сбалансирована по входящим в нее компонентам и дает хорошие результаты при культивировании клеток многих видов растений. Питательные среды для культуры клеток растений должны включать все необходимые минеральные и органические элементы в концентрациях, максимально приближенным к тем, которые получают интактные растения для нормального роста и развития в условиях in vivo: макро- и микроэлементы, витамины, углеводы. Добавка в питательную среду регуляторов роста растений позволяет стимулировать пролиферацию культур клеток или индуцировать процессы морфогенеза.

Культура клеток растений может быть получена и успешно поддерживаться только при условии соблюдения асептики. Это достигается благодаря использованию различных методов стерилизации помещений, лабораторной посуды, инструмента, питательных сред. Особо тщательно стерилизуют поверхность эксплантатов, предназначенных для получения культуры клеток. Все работы, при которых открывают культуральные сосуды (разлив стерильной питательной среды по пробиркам, чашкам Петри, колбам, вычленение эксплантатов и их перенос на питательную среду, перенос части культуры на свежую питательную среду и др.) проводят в стерильных условиях в рабочем пространстве ламинар-бокса с соблюдением правил асептики.

В зависимости от типа эксплантата и целей эксперимента для культуры клеток используют различные культуральные сосуды и условия культивирования. Культивирование производят в культуральных комнатах, оборудованных кондиционером, в темноте (в термостатах) или при освещении (на специальных стеллажах, оборудованных подсветкой или в климакамерах). Температурный и световой режим культивирования, спектральные характеристики света могут оказывать существенное влияние на пролиферацию клеток, индукцию процессов морфогенеза в культуре клеток растений.

Через определенные промежутки времени производят перенос культур на свежую питательную среду (пассирование, субкультивирование) для того, чтобы избежать истощения питательных сред, неблагоприятного эффекта метаболитов, выделяемых в среду в процессе культивирования, недостаточного объема культурального сосуда для разросшихся культур.

Дополнительная литература

1. Bhojwani S.S., Razdan M.K. Plant tissue culture: theory and practice. Elsevier. 1996.- 767 p.

Контрольные вопросы

1. Назовите основные элементы синтетических питательных сред для культуры клеток растений.

2. Для каких целей используют запасные растворы компонентов питательной среды?

3. Каким образом обеспечивают условия асептики при получении культуры клеток растений?

4. Для чего необходимо проводить субкультивирование клеточных культур?