ОБЛИГАТНЫЕ ФАКУЛЬТАТИВНЫЕ СПОСОБЫ ВЫРАЩИВАНИЯ

ГИДРОЛАЗЫ

ЭКЗО- И ЭНДОФЕРМЕНТЫ

ТРАНСФЕРАЗЫ

МИКРОАЭРОФИЛЫ КАПНЕИЧЕСКИЕ

ИЗОМЕРАЗЫ

КОНСТИТУТИВНЫЕ

И ИНДУЦИБЕЛЬНЫЕ

ЛИАЗЫ И ЛИГАЗЫ

Подавляющее большинство патогенных бактерий являются аэробами. По потребности в кислороде бактерии можно разделить на 5 групп:

1. Строгие (облигатные) аэробы, рост этих микроорганизмов прекращается в отсутствие О₂. К ним относятся, например, менингококки.

2. Строгие (облигатные) анаэробы не переносят доступа воздуха, так как образующиеся токсические производные кислорода (перекись водорода, супероксидный и гидроксильный радикалы, синглетный кислород) губительны для самих же бактерий из-за отсутствия у них ферментов (каталазы, пероксидазы, супероксиддисмутазы), разрушающих эти токсические продукты. К строгим анаэробам относятся клостридии столбняка, ботулизма, газовой гангрены, некоторые бактероиды. Среди множества патогенных бактерий их количество невелико.

3. Факультативные анаэробы наиболее обширная группа патогенных микроорганизмов, которые способны использовать в качестве акцепторов электронов как молекулярный кислород, так и органические соединения, а так же переключатся на процесс брожения в отсутствии молекулярного кислорода.

4. Микроаэрофильные бактерии хорошо растут при сниженном парциальном давлении кислорода, но при повышенном содержании СО₂ (представители рода Brucella).

5. Аэрофилы нуждаются в повышенном содержании кислорода (холерный вибрион, возбудители дифтерии, туберкулеза).

Ферменты бактерий

Питание микроорганизмов осуществляется благодаря наличию в клетке различных ферментов, катализирующих все жизненно необходимые реакции. Ферменты – это биологические катализаторы белковой природы. Микробная клетка, подобно клеткам высших организмов, оснащена достаточно активным ферментативным аппаратом. Ферменты микроорганизмов обладают теми же свойствами и функциями, что и ферменты высших организмов. В соответствии с катализирующими реакциями все ферменты разделяют на шесть классов:

1. Оксидоредуктазы - катализируют реакции окисления-восстановления.

2. Трансферазы - катализируют реакции переноса различных групп от донора к акцептору.

3. Гидролазы - катализируют разрыв связей в субстратах с присоединением воды.

4. Лиазы - катализируют реакции разрыва связей в субстрате без присоединения воды или окисления.

5. Изомеразы - катализируют превращения в пределах одной молекулы (внутримолекулярные перестройки).

6. Лигазы (синтетазы) - катализируют присоединение двух молекул с использованием энергии фосфатных связей.

Несмотря на малые размеры микробной клетки, распределение в ней ферментов строго упорядоченно. Ферменты энергетического обмена и транспорта питательных веществ локализованы в цитоплазматической мембране и ее производных. Ферменты белкового синтеза связаны с рибосомами. Многие ферменты не связаны с определенными структурами клетки, а находятся в цитоплазме в растворенном виде.

Ферменты бактерий подразделяются на экзо- и эндоферменты. Эндоферменты функционируют только внутри клетки. Они катализируют реакции биосинтеза и энергетического обмена. Экзоферменты выделяются клеткой в среду и катализируют реакции гидролиза сложных органических соединений на более простые, доступные для ассимиляции микробной клеткой. К ним относятся гидролитические ферменты, играющие исключительно важную роль в питании микроорганизмов.

В зависимости от условий образования ферментов их разделяют на конститутивные и индуцибельные. Конститутивными называют ферменты, синтезируемые клеткой вне зависимости от субстрата, на котором развиваются бактерии. Например, ферменты гликолиза. Индуцибельные ферменты синтезируются только в ответ на присутствие в среде необходимого для клетки субстрата-индуктора. Он взаимодействует с репрессором, инактивирует его, в результате чего включается генетический аппарат клетки и начинается синтез соответствующего фермента. Индуцированный синтез ферментов идет, пока в среде присутствует индуктор. При этом ферменты синтезируются заново во всех клетках одновременно. Индукторами биосинтеза являются многие питательные вещества. К индуцибельным относится большинство гидролитических ферментов.

Известны также ферменты, которые получили название аллостерических. Кроме активного центра у них имеется регуляторный или аллостерический центр, который в молекуле фермента пространственно разделен с активным центром. Аллостерическим (от греч. allos – иной, чужой) он называется потому, что молекулы, связывающиеся с этим центром, по строению (стерически) не похожи на субстрат, но оказывают влияние на связывание и превращение субстрата в активном центре, изменяя его конфигурацию. Молекула фермента может иметь несколько аллостерических центров. Вещества, связывающиеся с аллостерическим центром, называют аллостерическими эффекторами. Они влияют через аллостерический центр на функцию активного центра: или облегчают ее, или затрудняют. Соответственно аллостерические эффекторы называются положительными (активаторы) или отрицательными (ингибиторы). Аллостерические ферменты играют важную роль в тонкой регуляции метаболизма бактерий. Поскольку практически все реакции в клетке катализируются ферментами, регуляция метаболизма сводится к регуляции интенсивности ферментативных реакций.

Некоторые ферменты, так называемые ферменты агрессии, разрушают ткани и клетки макроорганизма, обуславливая тем самым распространение патогенных микроорганизмов и их токсинов в инфицированных тканях. К таким ферментам относятся плазмокоагулаза, нейраминидаза, коллагеназа, лецитиназа, гиалуронидаза и некоторые другие ферменты. Гиалуронидаза стрептококков, например, расщепляет гиалуроновую кислоту в мембранах клеток соединительных тканей макроорганизма, что способствует распространению возбудителей и их токсинов в организме, обуславливая высокую инвазивность этих бактерий.

Плазмокоагулаза является главным фактором патогенности стафилококков, так как участвует в превращении протромбина в тромбин, который вызывает образование фибриногена, в результате чего каждая бактерия покрывается пленкой, предохраняющей ее от фагоцитоза. Ферменты микроорганизмов, такие как лигазы и рестриктазы, нашли широкое применение в биотехнологии, в том числе в генетической инженерии, для получения различных биологически активных веществ, гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, а также ряда продуктов в легкой и пищевой промышленности.

Ферменты микроорганизмов характеризуют их биологические свойства и поэтому их исследуют с целью идентификации бактерий. В зависимости от субстрата гидролитические ферменты принято делить на две большие группы:

1 - гидролитические или сахаролитические ферменты, субстратом для которых являются различные сахара, а продуктами их расщепления – кислоты, спирты, альдегиды, Н₂О и СО₂;

2 - протеолитические ферменты, расщепляющие белки с образованием полипептидов, аминокислот, аммиака, индола, сероводорода.

Для изучения активности ферментов при идентификации микроорганизмов широко используют дифференциально-диагностические среды, в состав которых входят определенные субстраты – сахара или белки.

При исследовании гидролитической активности бактерий распространены моносубстратные дифференциально-диагностические среды Гисса (пестрый ряд Гисса), лактозосодержашие среды Эндо, Левина, Плоскирева, дисубстратные среды Ресселя, полисубстратные среды Клиглера и Олькеницкого. Последние могут служить и для изучения протеолитических свойств бактерий, так как рост микроорганизмов сопровождается высвобождением аммиака. Протеолитические ферменты бактерий определяются также по выделению индола, сероводорода, расщеплению некоторых аминокислот, например, фенилаланина, лизина, цистина. Протеолитические ферменты способны изменять (разжижать) желатину, причем, разные виды бактерий по разному изменяют «столбик» желатины в пробирке с посевом микроорганизма. Так, при росте холерного вибриона «столбик» желатины принимает форму гвоздя, при росте стафилококка – чулка, при росте синегнойной палочки наблюдается послойное разжижение среды.

Окислительно-восстановительные ферменты, дегидрогеназы, каталазу определяют по изменению органического красителя – акцептора водорода. Способность микроорганизмов использовать в качестве источника углерода цитрат оценивают в специальных тестах основанных на работе ферментов.

В практических бактериологических лабораториях широко применяют микро- и экспресс-методы для ориентировочного изучения биохимических свойств микроорганизмов. Для этой цели существует множество тест-систем. Наиболее часто используют систему индикаторных бумаг (СИБ). СИБы представляют из себя диски фильтровальной бумаги, пропитанные растворами сахаров или других субстратов в сочетании с индикаторами. Такие диски опускают в пробирку с выросшей в жидкой питательной среде культурой. По изменению цвета диска с субстратом судят о работе фермента. Микро-тест системы для изучения идентификации энтеробактерий представлены одноразовыми пластиковыми контейнерами со средами, содержащими различные субстраты, с добавлением индикаторов. Посев чистой культуры микроорганизмов в такие тест-системы позволяет быстро выявить способность бактерий утилизировать цитраты, глюкозу, сахарозу, выделять аммиак, индол, разлагать мочевину, лизин, фенилаланин и т.д.