Получение ферментных препаратов

Технология получения ферментных препаратов включает три основные стадии: получение посевного материала; получение производственной культуры микроорганизма путем его культивирования глубинным или поверхностным способом; получение технических или очищенных ферментных препаратов.

Первая и третья стадии технологии идентичны независимо от способа культивирования микроорганизмов.

Получение посевного материала. В качестве посевного материала используют исходный штамм продуцента, который заводская лаборатория получает из отраслевого НИИ или центральной лаборатории чистых культур. Необходимое количество посевного материала получают путем постадийного выращивания продуцента во всевозрастающих объемах среды в асептических условиях, гарантирующих исключение развития посторонней микрофлоры. Технологический процесс размножения посевного материала зависит от вида продуцента и способа культивирования его в производстве. Так, при глубинном способе культивирования посевной материал готовят также глубинным способом. В зависимости от масштабов производства используют три варианта.

Для предприятий с большой суточной мощностью – в четыре ступени: исходная культура продуцента → маточная культура, выращенная в колбах на жидкой или твердой питательной среде на качалке → посевная культура, выращенная в малом инокуляторе → посевная культура, выращенная в большом инокуляторе.

Для предприятий средней суточной мощности – исключают четвертую стадию.

Для предприятий малой мощности – исключают третью и четвертую стадии.

На всех стадиях размножение продуцента ведут при оптимальных температуре и рН.

На первой стадии в качестве субстрата используют агаризованную питательную среду, которую пересевают в виде водной суспензии из расчета 1−5 % на жидкую питательную среду в колбы вместимостью 0,75−1 л. Культуру выращивают на качалках и завершают в конце логарифмической фазы.

Культуру, полученную на второй стадии, называют маточной, ее можно использовать в качестве посевной для ферментатора небольшого объема.

На третьей стадии культуру из колб пересевают на свежую питательную среду из расчета 2−3 % к объему свежей среды. Цель этой стадии – обеспечить засев больших объемов производственной среды. Культивирование ведут до стадии физиологической зрелости.

Для четвертой стадии используют, как правило, среды, аналогичные производственным. Среды больших инокуляторов составляют 3−5 % объема производственного ферментатора. На третьей и четвертой стадиях среду аэрируют в строго определенное время.

Готовый посевной материал сразу передают в производство. Готовый материал не должен быть засорен посторонней микрофлорой, должен содержать определенное количество спор или клеток на единицу массы, стойко сохранять генетически заложенные в нем свойства продуцировать определенные ферменты.

Получение производственной культуры. Основными факторами, которые влияют на быстрый рост микроорганизмов и максимальный синтез ими ферментов, являются:

− состав питательных сред;

− условия приготовления и стерилизации этих сред;

− количество и способ подвода воздуха к растущей культуре;

− правильный выбор условий выращивания продуцента и контроля за этим процессом.

Основное условие,предъявляемое к составу питательной среды –это ее полноценность с точки зрения направленности синтеза целевого продукта.

В состав среды должны обязательно входить источники углерода в виде органических соединений, азота в виде органических или аммонийных соединений, кислорода в молекулярном виде или в качестве составной части органических соединений. В среде также обязательно наличие макро- и микроэлементов (калия, магния, железа и др.) и ростовых веществ.

В зависимости от состава среды делятся на синтетические и комплексные.Синтетические среды составляют на основании определенных количественных соотношений индивидуальных веществ, которые являются источниками углерода, азота, фосфора и т. д. Комплексные же среды представляют собой богатые органическими веществами продукты, в том числе и отходы ряда производств. Они значительно доступнее и дешевле, чем синтетические, поэтому чаще используются в промышленности.

При поверхностном культивировании в качестве основных компонентов питательной среды применяют отруби и муку из различных злаков, свекловичный жом, а при глубинном – свеклосахарную мелассу, замочные воды крахмало-паточного производства и др.

При приготовлении питательной среды для поверхностного культивирования к основному компоненту обязательно добавляют компоненты, улучшающие структуру (рыхлость) среды и содержащие источники основного фермента (биошрот, солодовые ростки и др.). Среды для глубинного культивирования обогащают питательными солями, гидролизатами белков, аминокислотами, углеводами, а также источниками ростовых веществ.

Питательные среды с содержанием сухих веществ от 1,5 до 10 % в зависимости от вида продуцента готовят на водопроводной воде.

Питательные среды готовят в стерилизаторе или специальной емкости с перемешивающим устройством, в которые дозируют отдельные компоненты среды, смешивают их с водой или водными растворами добавок. Приготовленную среду подвергают стерилизации, основной задачей которой является уничтожение микрофлоры, которая вносится в среду с компонентами, водой, воздухом и с поверхности аппаратуры. Стерилизацию твердых питательных сред для поверхностного культивирования проводят острым паром при температуре 104−140 °С в течение 60−120 мин, а жидких сред для глубинного культивирования – острым паром при температуре 110−145 °С в течение 5−90 мин. При высокой температуре (140−145 °С) длительность выдержки составляет 5−15 мин. Посевные кюветы и стеклянную посуду стерилизуют сухим жаром при температуре 160 °С не менее 1 ч, а аппаратуру и коммуникации – острым паром при температуре 105−120 °С в течение 1−1,5ч.

Стерильную питательную среду помещают в простерилизованный и охлажденный до 60−80 °С ферментатор.

Подавляющее большинство продуцентов ферментов – аэробы, для культивирования которых требуется воздух. Аэрация растущей культуры призвана выполнять три основные задачи:

− снабжение микроорганизма кислородом в количестве, необходимом для нормального развития;

− отвод газообразных продуктов обмена, в частности диоксида углерода;

− отвод выделяемой физиологической теплоты.

К воздуху предъявляют особые требования, которые включают стерильность и отсутствие механических включений. Стерильность воздуха достигается путем фильтрации через специальные фильтры или обработки воздуха антисептиками, высокими температурами, ионизирующим излучением и др.

Поверхностное культивирование микроорганизмов проводят в специальных растительных камерах, называемых кюветами, а глубинное – в ферментаторах.

Наиболее важными факторами,которые влияют на образование ферментов, являются:

− влажность питательной среды при поверхностном культивирова­нии;

− степень аэрации;

− длительность;

− величина рН;

− температура.

Оптимальное содержание влаги в твердой питательной среде составляет 50−70 %. При более низком содержании влаги (менее 40 %) микроорганизм слабо развивается и редко образует большое количество ферментов. Расход воздуха на аэрацию должен быть не менее 30−60 м³/(м³/ч). Оптимальная длительность культивирования устанавливается экспериментально в зависимости от вида продуцента и образуемого им фермента.

При поверхностном культивировании рН среды практически не изменяется, поэтому его влияние на образование ферментов минимально. При глубинном культивировании рН среды имеет решающее значение, так как его величина резко изменяется в процессе культивирования. Для стабилизации рН в питательную среду в процессе культивирования вводят минеральные кислоты или щелочи в зависимости от характера изменения рН. Микромицеты и дрожжеподобные организмы хорошо растут и образуют ферменты при рН от 3,8 до 5,6. Для бактерий лучшей является среда, в которой рН близок к нейтральному значению (6,2−7,4).

Большинство продуцентов ферментов – это мезофильные микроорганизмы, температурный оптимум их развития 22−32 °С. Среди бактерий часто встречаются термофилы, для которых оптимальная температура культивирования 35−60 °С. Термофильные микроорганизмы к тому же синтезируют ферменты, обладающие повышенной стойкостью к высоким температурам. Если микроорганизм термостабилен, то с повышением температуры до оптимальной для культивирования растет и скорость накопления фермента.

Получение очищенных ферментных препаратов. Доля ферментов в культуре микроорганизмов очень мала (0,5−1,0 % для поверхностных культур и 0,1−0,01 % для глубинных). Выделение и очистка ферментов – трудоемкий и дорогой процесс. Поэтому, если ферментный препарат можно использовать в виде неочищенной культуры микроорганизмов, очистку не производят. К таким отраслям относится, например, спиртовая, в которой качество продукции не зависит от степени очистки ферментного препарата.

Схема очистки фермента от балластных веществ включает в себя отделение нерастворимых веществ культуры микроорганизмов и отделение сопутствующих растворимых веществ и других ферментов.

В зависимости от особенностей продуцента и свойств выделяемого фермента схема очистки и получения ферментного препарата может включать такие приемы и методы, как водная экстракция, фильтрование, различные способы сушки, осаждение органическими растворителями и др. Ферментные препараты могут быть получены в виде порошка или жидких концентратов. Процесс выделения и очистки ферментов сопровождается повышением доли активного белка в общей массе препарата, что находит свое выражение в увеличении активности препарата. Так, в результате очистки активность α-амилазы возросла от 38 ед/г в поверхностной культуре до 6600 ед/г в кристаллическом препарате. Соответственно растет и стоимость получения очищенного препарата.