Нефелометрические коагулометры
Нефелометрические коагулометры определяют момент образования сгустка по изменению рассеяния света. Новейшие разработки в этой области технологий нашли воплощение в коагу-лометрах фирмы «Sysmex» (Япония), в которых используется принцип определения сгустка по боковому рассеиванию света (рис. 87). Метод рассеивания обеспечивает высокое качество анализов - высокую специфичность и чувствительность метода детекции сгустка даже для сложной липе-мичной или иктеричной плазмы.
Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ
Рис. 86. Оптический двухканальный коагулометр KG-1 производства компании «Соrmау».Точность результатов повышается за счет синхронизации времени попадания реагента в измерительную кювету и запуска отсчета времени, а также исключения из применения магнитных мешалок в измерительных кюветах, Прибор эргономичен, термостат для проб и реагентов размещен в самом приборе, у кювет есть перемычки и держатели для удобства переноса из термостата в измерительные ячейки. Работа на приборе экономна, так как снижен расход реагентов за счет уменьшения объема кювет, использования многоразовых кювет
Рис. 87. Нефелометрический принцип измерения светорассеяния,заложенный в основу определения момента выпадения сгустка на коагулометрах фирмы «Sysmex» (Япония). Метод позволяет повысить точность измерений и их воспроизводимость до 2-3%, а также снизить влияние на результат самого образца. Анализаторы работают на любых реагентах (в том числе на российских)
В табл. 15 указаны преимущества и недостатки автоматизированных коагулометров, использующих разные принципы регистрации выпадающего сгустка.
Современные коагулометры сочетают в одном приборе несколько методов измерения, по-
этому могут использоваться для комплексной оценки гемостаза. Так, фирма «Sysmex» предлагает серию коагулометров с разными возможностями и производительностью для любой клинико-диагностической лаборатории любого уровня исследования гемостаза (рис. 88).
Таблица 15
Преимущества и недостатки различных методов обнаружения сгустка
Методы | Преимущества | Недостатки |
Механический | Принципиальная возможность работы на цельной крови, высокая толерантность к типу используемых реагентов и пробирок, низкая стоимость анализаторов | Низкая чувствительность - нет детекции слабых сгустков, необходимо применять мешалки в пробах |
Оптико-механический | Точность больше, чем в механическом методе, перемешивание пробы во время снятия показаний | Чувствительность ниже нефело-метрического метода, необходимо применять мешалки в пробах |
Турбидиметриче-ский | Чувствительность выше предыдущих методов, низкая стоимость анализаторов | Чувствительность ниже нефело-метрического метода |
Нефелометрический | Высокая чувствительность, высокая точность измерения | Высокая стоимость прибора |
Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ
Рис. 88. Коагулометры фирмы «Sysmex»
Амидолитические методы с использованием хромогенных и флуорогенных субстратов
Применение синтетических хромогенных субстратов явилось прорывом при исследовании отдельных ферментов или ингибиторов, которые не учитываются простыми коагуляционными тестами или очень трудны для стандартизации. Во многих случаях хромогенные субстраты являются специфичными и позволяют определить протеолити-ческую активность отдельных компонентов плазменного гемостаза и их ингибиторов. Эти тесты схожи с тестами клинической химии, поэтому легко автоматизируются и могут выполняться на биохимических анализаторах как в клинико-диагностических, так и в научных лабораториях.
Принцип тестов с хромогенными субстратами представлен на рис. 89. Протеаза расщепляет короткоцепочечный пептид (из 3-10 аминокислот), к которому через эфирную связь пришит хромоген (в нашем случае паранитроанилин -pNA). Комплекс пептид-pNA имеет максимум поглощения в области короткого ультрафиолета, свободный pNA - при 380 нм. Итоговая концентрация pNA пропорциональна активности протеазы и определяется по увеличению поглощения светового пучка с длиной волны 405 нм.
Рис. 89. Принцип определения активности протеолити-ческого фермента (протеазы) с использованием хро-могенного субстрата.Максимум поглощения паранитро-анилина, связанного с пептидом, находится в области короткого ультрафиолета, а свободного паранитроанилина -380 нм, При длине волны 405 нм поглощает практически только свободная форма хромогена, на этой длине волны проводится регистрация протеолитической реакции
Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ
Для оценки активности факторов гемостаза стали использовать флуорогенные субстраты,в
частности 7-амино-4-метилкумарин (АМК), который имеет максимум эмиссии при 440 нм. Флуорогенные субстраты обладают большей аналитической чувствительностью и позволяют измерить специфическую активность компонентов гемостаза в большем диапазоне, чем хромогенные субстраты. Они могут использоваться для определения компонентов гемостаза, присутствующих в плазме в следовых концентрациях или обладающих относительно низкой активностью.
Преимущества использования хромогенных и флуорогенных субстратов:
• Высокая чувствительность метода. pNA или
АМК обладают фотометрическими характе
ристиками, позволяющими использовать ки
нетические методы измерения.
• Высокая специфичность. Для каждой отдель
ной сериновой протеазы системы гемостаза
известна структура участка гидролиза. Моде
лирование в короткоцепочечном пептиде спе
цифической для конкретной протеазы после
довательности из 3 аминокислот позволяет
исключить влияние других протеаз на резуль
таты исследования. При синтезе хромогенных
субстратов для повышения специфичности
используются L- или D-стереоизомеры амино
кислот, а также различные блокирующие груп
пировки, чтобы предупредить деградацию их
неспецифическими аминопептидазами. Кроме того, в тестах используется концентрация хромогенных субстратов в несколько сотен мкмоль/л, что существенно выше, чем константа Михаэлиса (Км) соответствующих ферментов, поэтому скорость реакции не зависит от концентрации субстратов. Факторы, которые необходимо учитывать при использовании хромогенных субстратов в практической клинико-диагностической лаборатории:
• Растворимость субстратов должна быть хо
рошей.
• Реакция должна быстро достигать линей
ность, чтобы использовать соответствующий
набор на биохимических анализаторах, в ко
торых часто бывает ограниченным время
проведения измерения.
• В пробе не должно быть мутности, которую
часто привносит фибрин или денатурирован
ные белки.
Недостатки метода с использованием хромогенных субстратов:
• Высокая стоимость реактивов.
• Возможное завышение результатов при иссле
довании активности витамин-К-зависимых фак
торов у лиц, получающих непрямые антикоа
гулянты либо имеющих дефицит витамина К.
Некоторые хромогенные субстраты, исполь
зуемые для определения активности факторов
свертывания, представлены в табл. 16.
Таблица 16
Типичные хромогенные и флуорогенные субстраты и ингибиторы, применяемые для выявления активности протеолитических ферментов системы гемостаза
Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ
Дата добавления: 2016-08-06; просмотров: 1736;