Агрегация тромбоцитов

Агрегацию тромбоцитов исследуют на агре-гометре с использованием индукторов агрегации. Требования к пробам критичны. Исследование агрегации проводят на плазме, богатой тромбо­цитами (ПБТ, английская аббревиатура PRP). Желательно использовать ПБТ, содержащую примерно 200 клеток/нл. Это требование затруд-

няет оценку агрегации тромбоцитов при тромбо-цитопении.

Пробы помещаются в кювету агрегометра, который представляет собой оптический прибор с регистрацией проходящего света. Проба в кю­вете постоянно перемешивается специальной ме­шалкой. При формировании агрегатов повыша-

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

ется прозрачность плазмы и, следовательно, уве­личивается поток проходящего через кювету све­та (рис. 76). Изменение светопропускания регис­трируется в виде кривой.

Агрегация с АДФ

Характер агрегации тромбоцитов при ин­дукции АДФ зависит от дозы. Как правило, при концентрации 0,5-1 мкмоль возникает обрати­мая агрегация, при концентрации до 5 мкмоль -двухфазная агрегация, при большей концентра­ции (до 10 мкмоль) - необратимая однофазная агрегация (или агрегация, при которой неразли­чим переход от 1-й до 2-й волны).

При связывании на поверхности тромбоци­тов АДФ с рецептором происходит изменение формы тромбоцитов, экспозиция на мембране комплекса GPIIb-IIIa (рецептор для фибриноге­на) и первичная Са-зависимая агрегация. Если первичный ответ на АДФ не будет поддержан вторичной реакцией, то в отсутствии фибриноге­на происходит десенситизация рецепторов, кото­рая приводит к дезагрегации тромбоцитов. Вто­ричная агрегация опосредована внутриклеточной передачей сигнала через G-белки с повышением внутриклеточной концентрации Са²⁺. Происхо­дит активация простагландин-тромбоксановой системы, развивается секреция из α-гранул vWF, β-тромбоглобулина, тромбоспондина, фибронек-тина и других активных компонентов, развива­ется вторичная агрегация.

Выяснение путей АДФ-активации тромбоци­тов позволило использовать в клинике антиагре-гационные соединения. Оказалось, что тиклопи-

дин и клопидогрель селективно ингибируют ак­тивацию G-белка, АДФ-агрегацию и активность стимулированной аденилатциклазы.

Агрегация с адреналином

Особенности агрегации с адреналином в зна­чительной степени обусловлены концентрацией Са²⁺ в среде. При физиологических концентра­циях Са²⁺ (1-2 ммоль, которая характерна для плазмы крови) адреналин не вызывает актива­ции тромбоцитов и их агрегации. При значи­тельном снижении Са²⁺ в цитратной плазме до 20-40 мкмоль адреналин вызывает дозозависимую агрегацию с экспрессией комплекса GPIIb-IIIa при первичной волне агрегации и ТХА₂-опосре-дованную вторичную волну (рис. 28).

По-видимому, в условиях организма прямая адреналиновая агрегация отсутствует, что связа­но с относительно высокой концентрацией Са²⁺ в плазме и низкой концентрацией самого адрена­лина. Однако адреналин, очевидно, потенцирует действие других агонистов, что проявляется уже при его концентрации порядка 0,01 мкмоль. По­этому при курении, стрессе и особенно кардио-генном шоке, когда уровень адреналина в крови повышается до 0,6 мкмоль, он становится суще­ственным фактором внутрисосудистой агрегации тромбоцитов.

Агрегация с тромбином

Тромбин - очень сильный физиологический индуктор агрегации. Воздействие тромбина на тромбоцит опосредовано собственным рецепто-

Рис. 76. Принцип оценки индуцированной агрега­ции. А- до агрегации; Б -агрегация. После добавле­ния индуктора агрегации и формирования агрегатов тромбоцитов происходит просветление суспензии

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

ром (рис. 20) и GPIbα. Стимуляция тромбиново-го рецептора сопровождается активацией тром­боцитов через G-белок, фосфолипазы С и вклю­чение фосфоинозитольного механизма актива­ции. Этот путь сопровождается быстрым увели­чением концентрации цитозольного Са²⁺ и сек­рецией α-гранул и электронно-плотных 5-гранул. Секретируемый из 5-гранул АДФ существенен для образования агрегатов, а выделяемые α-гра-нулами фибриноген, vWF, тромбоспондин - для их стабилизации. Оккупация молекулами тром­бина высокоаффинных рецепторов GPIbα приво­дит к перестройке фосфолипидной мембраны, стимуляции ее прокоагулянтной активности и повышению аффинности GPIIb-IIIa. В результа­те комплексной стимуляции тромбином практи­чески не наблюдается двухволновой агрегации.

Агрегация с арахидонатом

Арахидоновая кислота в цитратной плазме вызывает дозозависимое изменение формы тром­боцитов, первичную и вторичную агрегацию. Арахидонат активирует тромбоциты без участия специфических рецепторов, проникая внутрь клетки, активируя свои метаболиты - ПГG₂,

ПГН₂ и тромбоксан. Эту особенность активации тромбоцитов арахидоновой кислотой использу­ют для дифференциации нарушений, связанных с дефицитом пулов хранения и нарушениями в цик-лооксигеназном пути активации тромбоцитов.

Вид агрегатограммы зависит от типа и концен­трации индуктора. Наиболее распространенные индукторы АДФ и адреналин используются в не­скольких концентрациях. Форма агрегатограммы может быть несколько отлична на агрегометрах разных производителей, так как выводимый резуль­тат теста в определенной степени зависит от скоро­сти и характера перемешивания, температуры, спо­соба регистрации и некоторых других факторов.

Лекарственные средства, такие, как аспирин и другие нестероидные противовоспалительные препараты, антибиотики (3-лактамного ряда, не­которые витамины, пряности могут быть причи­ной нарушенной агрегации. Из вышесказанного следует, что для адекватной оценки результатов теста требуется тщательная стандартизованная подготовка больных и стандартизация протоко­ла аналитических процедур.

Болезнь Виллебранда и врожденные наруше­ния функции тромбоцитов легко диагностируют­ся агрегатометрией (табл. 14).

Изменения агрегатограмм при нарушениях функции тромбоцитов

Таблица 14

Н- нормальная агрегатограмма, 4- - сниженная реакция на индуктор агрегации.