Глава 4. ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК, ИЛИ ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Технология рекомбинантных ДНК (также молекулярное клонирова­ние, или генная инженерия) - это совокупность экспериментальных процедур, позволяющих осуществлять перенос генетического материа­ла (ДНК) из одного организма в другой. В настоящее время можно вы­резать отдельные участки ДНК, получать нуклеотиды на ДНК-синтезаторах (приборах для автоматического химического синтеза ДНК) практически в неограниченном количестве, определять последо­вательность нуклеотидов (разделяя, секвенируя их) сотнями в сутки, изменять выделенный ген, вводить его вновь в геном культивируемых клеток или эмбриона животного, где этот измененный ген начинает функционировать. Эксперименты с рекомбинантными ДНК используют крупномасштабно в промышленном производстве БАВ. Эксперименты по клонированию включают следующие этапы:

1. Рестриктазное расщепление из организма-донора нужных генов нативной ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чужеродная ДНК).

2.Быстрая расшифровка всех нуклеотидов в очищенном фрагмен­те ДНК, позволяющая определить точные границы гена и ами­нокислотную последовательность, кодируемую геном.

3. Обработка рестрикционными эндонуклеазами вектора для кло­нирования, который может реплицироваться в клетке-хозяине.

4. Сшивание ДНК-лигазой двух фрагментов ДНК с образованием новой рекомбинантной молекулы - конструкция «клонирующий вектор - встроенная ДНК».

5. Введение этой конструкции в клетку хозяина (реципиента), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс назы­вается трансформацией. После трансформации бактериальная клетка воспроизводит фрагмент клонируемой ДНК миллионами идентичных клеток.

6. Идентификация и отбор клеток, несущих рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки).

7. Получение специфичного белкового продукта, синтезированно­го клетками-хозяевами (рис. 6).

Конструирование рекомбинантных молекул осуществляется с по­мощью ряда ферментов — обязательного и незаменимого инструмента практически всех этапов этого сложного процесса, прежде всего фер­ментов рестрикции (рестрицирующих эндонуклеаз, рестриктаз). Рест-риктазы являются составной частью системы рестрикции — модифика­ции прокариотических клеток. Эта система связана с защитой клеток от проникновения чужеродной ДНК. Система модификации осуществляет метилирование собственной ДНК в сайтах ее узнавания немедленно после репликации; чужеродную ДНК, проникающую в клетку, бактерии гидролизуют с помощью рестриктаз.

Различают три основных класса рестриктаз. Рестриктазы класса I разрывают молекулы ДНК в произвольных точках, рестриктазы I и III классов обладают метилирующей и эндонуклеазной активностью. Фер­менты II класса, которые и используются в генной инженерии, состоят из двух отдельных белков: рестрикционной эндонуклеазы и модифици­рующей метилазы.

В настоящее время используется свыше 400 различных рестриктаз. Эти ферменты синтезируют самые разнообразные микроорганизмы. Для их культивирования необходимы оптимальные условия (темпера­тура, состав и рН среды, концентрация кислорода и т.д.). С целью по­вышения продуктивности и стандартизации процесса получения этих ферментов клонируют гены рестрицирующих эндонуклеаз в Е. соli.

Рестриктазы узнают и расщепляют специфические нуклеотидные последовательности в двухцепочечной молекуле ДНК. При молекуляр­ном клонировании важно, чтобы расщепление донорной и векторной ДНК происходило в строго определенных участках (сайтах). Каждый фермент рестрицирующих эндонуклеаз «опознает» в ДНК специфиче­скую последовательность из 4-6 нуклеотидов. Многие рестрицирующие эндонуклеазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на не­сколько нуклеотидов, располагаясь наискось друг от друга. Б результа­те образуются одноцепочечные комплементарные концы с «хвостами» из 4-х нуклеотидов в каждом («липкие» концы). Кроме рестриктаз, расщепляющих нуклеотидную цепь с образованием липких концов, су­ществуют рестриктазы, вносящие разрывы в цепи строго друг против друга с образованием ДНК с «тупыми концами».

Одних ферментов рестрикции при молекулярном клонировании не­достаточно, так как водородные связи между теми четырьмя основа­ниями, которые образуют липкие концы, не столь прочны, чтобы удер­жать два объединившихся фрагмента ДНК. Для устранения разрыва в сахарофосфатном остове молекулы служит фермент ДНК-лигаза, ката­лизирующий образование фосфодиэфирных связей между концами по-линуклеотидных цепей, которые удерживаются вместе при спаривании липких концов. ДНК-лигаза сшивает и тупые концы.

Таким образом, одна часть рекомбинантной молекулы ДНК несет нужный ген, который предполагается клонировать, другая — содержит информацию, необходимую для репликации в клетке рекомбинантной ДНК. Кроме того, при ДНК-рестрикции образуются разнообразные фрагменты и после их лигирования (соединения фосфодиэфирной свя­зью) с векторной ДНК появляется множество различных комбинаций фрагментов, например, объединяющих между собой фрагменты донорной ДНК и векторные ДНК. Для уменьшения количества последних рестрицированную векторную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой.

Для введения рекомбинантной ДНК применяют два основных век­тора:

1) Плазмиды.

2) Бактериофаги.

Плазмиды представляют собой внехромосомный генетический элемент в виде кольцевых молекул ДНК, содержащих 1-3% генома бак­териальной клетки. Плазмиды есть у всех бактерий. Одни из них содер­жат информацию, обеспечивающую их собственный перенос из одной клетки в другую (Р-плазмиды), другие - несут гены устойчивости к ан­тибиотикам (R-плазмиды) или специфические наборы генов, ответст­венных за утилизацию метаболитов (плазмиды деградации). Каждая плазмида содержит сайт начала репликации, без которого репликация плазмиды в клетке-хозяине невозможна. Если две или более плазмиды не могут сосуществовать в одной и той же клетке — они принадлежат к одной группе несовместимости. Плазмиды, относящиеся к разным группам несовместимости, беспрепятственно существуют в одной клет­ке независимо от числа копий. У некоторых микроорганизмов в одной клетке обнаружено до 10 разных плазмид, каждая из которых выполня­ла свои функции и относилась к своей группе несовместимости. Репли­кация плазмид идет независимо от репликации хромосом. Количество копий определяется регуляторной системой клетки.

Таким образом, плазмиды обладают свойствами, позволяющими использовать их в качестве вектора для переноса клонируемой ДНК. Бактериальный клон, содержащий такую плазмиду, можно сравнить с фабрикой по производству этого фрагмента.

Плазмидные векторы, как правило, создают методом генной инже­нерии, так как природные (немодифицированные) плазмиды лишены ряда обязательных для «высококачественного вектора» свойств:

• небольшого размера, так как эффективность переноса экзоген­ной ДНК в Е. соli снижается при длине плазмиды более 15 ты­сяч пар нуклеотидов;

• наличия сайта рестрикции, в который осуществлена вставка;

• наличия одного или более селективных генетических маркеров для идентификации реципиентных клеток, несущих рекомби-нантную ДНК.

Вводят плазмиды в соматические клетки с помощью химических реагентов, повышающих проницаемость клеточной оболочки. В част­ности, чтобы обеспечить проникновение в клетки плазмидной ДНК, их обрабатывают ледяным раствором кальция хлорида, затем выдержива­ют при 42 °С в течение 1,5 мин. Эта обработка приводит к локальному разрушению клеточной стенки. Максимальная частота трансформации - 10 , т.е. на каждую тысячу клеток приходится одна трансформиро­ванная. Частота трансформации не бывает 100%-й, затем используют схемы отбора, позволяющие идентифицировать трансформированные клетки.

В качестве маркеров плазмида может содержать гены, определяю­щие устойчивость бактерии к антибиотикам. Вставка чужеродного (до-норного) гена в маркерный ген приводит к инактивации последнего. Это позволяет отличать трансформированные клетки, получившие век­торную плазмиду (утратившие устойчивость к антибиотику), от клеток, получивших рекомбинантную молекулу (сохранивших устойчивость к одному, но утративших устойчивость к другому антибиотику). Этот прием называется инактивацией маркера вставки.

Для отбора трансформированных клеток, содержащих рекомби­нантную ДНК (гибридную плазмиду), проводят тестирование на рези-стентность к определенным антибиотикам. Например, клетки, несущие гибридную плазмиду, устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину (в маркерный ген которого и внедрена донорная ДНК).

Процесс разделения геномной ДНК на клонируемые элементы и введения этих элементов в клетки-хозяева называется созданием геном­ной библиотеки (банка клонов, банка генов).

Все системы клонирования должны отвечать двум основным требо­ваниям:

1)Наличию нескольких сайтов для клонирования;

2) Возможности достаточно простой идентификации клеток с ре-комбинантными ДНК.

Для всех рутинных процедур молекулярного клонирования широко используется Е. соli в качестве клетки-хозяина. Клетки, способные по­глощать чужеродную ДНК, называются компетентными; компетент­ность Е.соli повышают, используя специальные условия культивирова­ния. Для получения больших количеств чужеродных белков с помощью рекомбинантных штаммов Е. соli была сконструирована плазмида, со­держащая сильный промотор, селективный маркерный ген и короткий участок с несколькими уникальными сайтами для рестрицирующих ферментов - полилинкер.

Эффективными методами трансформации Е. соН плазмидами явля­ется электропорация (воздействие на клеточные мембраны электриче­ским током для увеличения их проницаемости). Для введения клониро­ванных генов в соматические клетки также применяют микроинъекции и микроукалывания или слияние с клеткой нагруженных ДНК мембран­ных везикул (липосом).

Использование бактериофагов в качестве носителей генетической информации основано на том, что рекомбинантный ген встраивается в геном вируса ив последующем реплицируется с генами вируса при размножении в инфицированной клетке-хозяина. С этой целью приме­няют бактериофаг ^.-вирус с двухцепочечной ДНК, которая после про­никновения в клетку смыкается в кольцо. Бактериофаг М-13 - вирус нитевидной формы с кольцевой замкнутой ДНК, которая в клетке пре­вращается в двухцепочечную и реплицируется в клетках-потомках. В поисках эукариотических систем экспрессии, для получения биологиче­ски активных белков, созданы бакмиды - экспрессирующие векторы на основе бакуловирусов для Е. соН и клеток насекомых. Выход рекомби­нантных бакуловирусов в такой системе повысился до 99%. Клетки на­секомого, инфицированные бакуловирусами, синтезировали гетероло-гичный белок. Векторы на основе фага удобны для создания клонеток (банка генов), но не для тонких манипуляций сфрагментом ДНК. Для детального изучения и преобразования фрагменты ДНК переклонируют в плазмиды.

Кроме указанных векторов в генной инженерии применяют косми-ды - плазмиды, несущие соs-участок (комплементарные липкие концы) ДНК фага X. Наличие соs-участка позволяет производить упаковку ДНК в головку фага in vitro, что обеспечивает возможность их введения в

клетку путем инфекции, а не трансформации. Фазмиды - гибриды ме­жду фагами и плазмидами - способны развиваться как фаг и как плаз-мида. Уступая космидам по клонирующей емкости, фазмиды дают воз­можность отказаться от переклонирования генов из фаговых в плазмид-ные векторы.

Таким образом, для получения любого белкового продукта необхо­димо обеспечить правильную транскрипцию кодирующего его гена и трансляцию соответствующей мРНК. Для инициации транскрипции (синтеза РНК) в нужном сайте необходим промотор, для ее остановки -терминирующий кодон.

Для синтеза разнообразных белков, кодируемых клонированными генами, интенсивно используют обычные дрожжи S. сегеvisiае; генетика этих одноклеточных организмов хорошо изучена. Рекомбинантные бел­ки, синтезированные в системах экспрессии S. сегеvisiае, применяют в качестве вакцин и лекарственных препаратов

Придавать новые свойства существующим белкам, создавать уни­кальные ферменты возможно, производя специфические изменения с помощью плазмид или ПЦР. Клонированные гены позволяют получать белки, содержащие нужные аминокислоты в заданных сайтах. Внесение специфических изменений в кодирующие последовательности ДНК, приводящие к определенным изменениям в аминокислотных последо­вательностях, называется направленным мутагенезом.

Тест-контроль к главе 4 Выберите правильные ответы:

1. Утверждение, что генетическая рекомбинация заключается в об­мене генами между двумя хромосомами:

А - верно;

Б - ошибочно;

В - требует уточнения.

2.Процесс изготовления генно-инженерных препаратов включает:

А - копирование гена человека, ответственного за синтез необходи­мого продукта;

Б - модификацию генетического аппарата больного для увеличения

биосинтеза необходимых продуктов;

В - внедрение микробной клетки с рекомбинантной ДНК в организм

человека;

Г - культивирование и выделение микробных клеток с рекомби-

нантными ДНК;

Д - внедрение микробной клетки с рекомбинантной ДНК в организм

животного;

Е - внедрение человеческого гена в плазмиду микробной клетки.

3.Функциональная активность рестрицирующих эндонуклеаз:

А - метилирование нуклеотидов;

Б — гидроксилирование нуклеотидов;

В - расщепление ДНК;

Г — сшивка нуклеотидов;

Д - репликация нуклеотидов.

4.Функциональная активность ДНК-лигаз:

А - лизирование (растворение, гидролиз) ДНК;

Б - образование фосфодиэфирных связей между концами полинук-

леотидных цепей;

В — метилирование нуклеотидов;

Г - нейтрализация ДНК;

Д - расщепление ДНК.

5. Защита клеток от проникновения чужеродной ДНК заключа­ется в:

А - регулировании проницаемости клеточной мембраны;

Б — укрупнении чужеродной ДНК;

В - гидролизе (расщеплении) чужеродной ДНК;

Г — метилировании чужеродной ДНК;

Д — нейтрализации чужеродной ДНК.

6. Для введения рекомбинантной-ДНК в производстве препаратов методом генной инженерии используют:

А — хромосомы;

Б - плазмиды;

В - рибосомы;

Г - бактериофаги;

Д - лизосомы;

Е - ядра клеток.

7. Плазмида представляет собой:

А — определенный штамм кишечной палочки, используемый для

биотехнологических целей;

Б - кольцеобразную молекулу ДНК;

В - участок цепи РНК, несущий информацию о структуре гена;

Г - внехромосомный элемент генетической информации;

Д — вирус, размножающийся в цитоплазме микробной клетки;

Е — хромосому, используемую в качестве вектора для введения ДНК

в клетки бактерий.

8. Требования к векторам ДНК:

А - малый размер;

Б — большой размер;

В - видоспецифичность;

Г - наличие селективных генетических маркеров для идентифика­ции реципиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК;

Д - наличие сайта рестрикции, в который осуществлена вставка.

9. Отбор трансформированных клеток, содержащих рекомбинант­ную ДНК (гибридную плазмиду) проводят:

А - тестированием на резистентность к различной температуре;

Б — тестированием на резистентность к определенным антибиоти­кам;

В - по способности окрашиваться гематоксилином; Г — по морфологическим признакам; Д — по скорости роста и размножения.

10. Способы введения клонированных генов в соматические клетки:

А - микроинъекции; '

Б - с помощью химических реагентов, изменяющих проницаемость

мембран;

В - с помощью липосом, «теней» эритроцитов;

Г - экстракорпоральной обработкой хромосом бактериальной

клетки;

Д - инфекцией клетки рекомбинантными вирусами.