Методы контроля биомассы и количества клеток при культивировании. Апоптоз и некроз клеток
Под определением биомасса подразумевается общая концентрация микроорганизмов или клеток на твёрдой или жидкой питательной среде при культивировании. Наиболее чувствительный метод контроля биомассы - подсчёт клеток с определением линейных размеров или числа жизнеспособных клеток (метод окрашивания) при помощи микроскопа. Количество клеток в биомассе можно контролировать и по объёму осаждения в центрифужных стаканчиках. Также используют косвенные методы определения биомассы по интенсивности дыхания (изменению концентрации СО2 инфракрасным газоанализатором) или содержанию белка (самый чувствительный метод - бромсульфалеиновая проба, основанная на связывании бромсульфалеина основными группами белка). Количество микроорганизмов и клеток можно определять физикохимическими методами: кондуктометрически (по удельной электропроводимости), спектрофотометрически, колориметрически, нефелометри-чески.
Гибель клеток ведёт к выделению клеточных фрагментов, загрязняющих фильтры и пробы, высвобождению внутриклеточных ферментов.
Гибель клеток идёт по двум механизмам: апоптоз и некроз.
Погибать могут, казалось бы, вполне жизнеспособные клетки, т.е. те, которые еще не успели исчерпать свои жизненные ресурсы. Зачастую активную роль в своей гибели играет сама клетка — с помощью содержащихся в ней механизмов, которые лишь запускаются теми или иными факторами внеклеточной или внутриклеточной среды; в результате возникло представление об апоптозе или программированной клеточной гибели. Апоптоз определяют, как программируемую клеточную смерть, понимая под этим такую гибель клетки, в развитии которой активную роль играют специальные и генетически запрограммированные внутриклеточные механизмы.
Исходный смысл слова «апоптоз» весьма поэтичен, по-гречески он означает опадание листьев.
Круг обстоятельств, когда в клетке включается программа апоптоза, весьма широк, их можно представить двумя группами:
-«неудовлетворительное» состояние самой клетки, что вызывает апоптоз изнутри;
-«негативная» сигнализация снаружи, передающаяся через специальные рецепторы клетки («апоптоз по команде»).
О «неудовлетворительном» состоянии самой клетки может свидетельствовать серьезное повреждение хромосом и внутриклеточных мембран. В этом смысле апоптоз выполняет функцию уничтожения дефектных клеток. Важнейший инструмент апоптоза - цитоплазматиче-ские протеазы, ядерные эндонуклеазы, последние разрушают ДНК не до нуклеотидов, а лишь до более или менее крупных фрагментов. К прочим «орудиям» апоптоза относится совокупность сильных окислителей - избыточное накопление не только оксида азота, но и других реакци-онноактивных веществ — супероксидного и гидроксидного радикалов, пероксинитрита, нитритов, нитратов и т.д. Известно, что в нормальной клетке существуют механизмы защиты от радикалов и окислителей. Это ферменты антиоксидантной системы: супероксиддисмутаза (превращает супероксид в перекись водорода), каталаза и пероксидаза, элиминирующие из среды пероксид водорода.
Повреждения клеток могут быть вызваны изменением температуры, нарушением питания. Если же повреждения клетки чрезмерны, процесс ее гибели становится неуправляемым - это уже некроз.
Таким образом, в зависимости от интенсивности и характера повреждающих воздействий гибель клетки может пойти либо по апопти-ческому, либо по некротическому пути.
Дата добавления: 2016-07-22; просмотров: 3245;