ЭКСТРАГИРОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ ИЗ ПОВЕРХНОСТНЫХ КУЛЬТУР

Все ферменты являются водорастворимыми белками, поэтому наилучшим экстрагентом для них является вода. Для извлечения ферментов из дрожжей или бактерий необходимо подвергнуть механическому или автолитическому разрушению их клеточные стенки, обладающие высоким диффузионным сопротивлением. Оболочки мицелиальных нитей имеют меньшее диффузионное сопротивление, чем оболочки бактериальных и дрожжевых клеток, поэтому дезинтеграции культуры грибов не требуется.

Извлечение ферментов проводят как из влажных, так и из сухих поверхностных культур грибов. Сухая культура может храниться длительное время без потери активности ферментов, и из нее получают более концентрированные экстракты. Технологически это выгоднее, но при подсушивании культуры имеют место потери активности, и потому экстрагирование целесообразно вести из влажной культуры. При экстрагировании различные водорастворимые вещества извлекаются из культуры с неодинаковой скоростью, происходит их частичное фракционирование, удельная активность ферментов в экстракте повышается в 3,5-4 раза по сравнению с исходной культурой в результате отделения большой части веществ (до 75%) с нерастворимым остатком - биошротом.

На полноту экстрагирования ферментов из культур оказывают влияние многие факторы: температура, рН, длительность процесса, конструктивные особенности экстракционных аппаратов, природа извлекаемого фермента, количество отобранного экстракта с единицы массы загруженной в аппарат культуры и т. д.

Влияние длительности экстрагирования и вида культуры представлено на рис. 1.43. Из рисунка видно, что одновременно с ферментами экстрагируются многие другие соединения, и часто скорость извлечения балластных веществ больше скорости экстрагирования из культуры целевого фермента.

Поэтому рациональнее пойти на некоторые потери фермента и закончить экстрагирование на оптимальном значении отношения активности фермента в экстракте к сумме извлекаемых веществ. Этот вопрос решается экспериментально для каждого вида продуцента.

Влиять на процесс экстрагирования с помощью такого фактора, как температура, практически невозможно, так как ферменты очень термолабильны и инактивируются даже при 35-40 °С (рис. 1.44). Кроме того, повышение температуры до 35-40 °С влечет за собой увеличение содержания сухого вещества в экстракте и уменьшение удельной ферментативной активности на 1 г сухого вещества, повышение опасности инфицирования экстрактов. Поэтому при проведении экстракции в заводских условиях стремятся подавить развитие микрофлоры путем максимального снижения температуры воды до 22-25 °С и применения антисептиков (формалин, бензол, толуол, хлороформ и др.). В большинстве случаев ферменты наиболее полно извлекаются при рН 5-7 (рис. 1.45).

Для получения концентрированных экстрактов при небольших потерях ферментов с биошротом необходимо применять специальные экстракционные установки. До недавнего времени для этого широко использовались диффузионные батареи (рис. 1.46). В них можно получить экстракт с содержанием сухого вещества от 7 до 14% в зависимости от вида культуры, среды и величины отбора экстракта.

Остановимся несколько подробнее на работе диффузионной батареи. Принцип этой работы представлен на рис. 1.47.

Диффузор представляет собой цилиндро-коническую емкость, снабженную рубашкой. В центральную цилиндрическую часть аппарата помещают сухую или влажную поверхностную культуру и фиксируют ее двумя сетками снизу и сверху (см. рис. 1.47, а). Экстрагент подают в диффузор № 1 снизу, обычно это вода с температурой 22-28 °С, и заполняют диффузор полностью до уровня сливной трубы. Подача воды прекращается на определенное время (в зависимости от вида фермента это может быть от 30 до 60 минут), затем вновь включают подачу воды и с помощью свежей воды вытесняют экстрагент из диффузора № 1 в диффузор № 2 до его полного заполнения, и вновь вся система останавливается на определенное время. Таким образом все повторяется до тех пор, пока в последнем, восьмом диффузоре экстрагент простоит еще τ₈, т. е. если τ = 30 мин, то τ_общ будет 4 часа (0,5 ч х 8).

После этого отбирают готовый экстракт. Непрерывность работы батареи обеспечивается наличием в системе 10 диффузоров (см. рис. 1.47, б). После прохождения первого цикла экстракции через 8 диффузоров в диффузоре № 1 уже прошла 8-ми кратная экстракция, там в культуре практически нет ферментов, поэтому этот (№ 1) диффузор отключается для разгрузки, вода подается на диффузор № 2, а в конце процесса диффузор № 9 заполняется свежей культурой и съем экстракта через 30 минут настаивания производят с диффузора № 9. К этому времени диффузор № 1 разгружен и вымыт, диффузор № 10 загружен свежей культурой, диффузор № 2 отключен на разгрузку, вода подается на диффузор № 3 и т. д. Фактически диффузионная батарея работает в непрерывном режиме: каждый диффузор периодически; находится в головном, промежуточном и хвостовом состоянии.

Но эти установки для экстрагирования ферментов из поверхностной; культуры имеют сравнительно небольшую производительность, требуют больших затрат ручного труда и в них наблюдаются сравнительно большие потери активности.

Поэтому постоянно ведутся исследования и поиск наиболее совершенной конструкции по экстракции ферментов из поверхностных культур микроорганизмов в непрерывном режиме и с минимальной затратой ручного труда. На ферментных предприятиях нашей страны успешно испытывался и определенное время с хорошими показателями работал диффузионный аппарат конструкции С. М. Гребенюка (см. рис. 1.48).

Экстрактор состоит из горизонтального корпуса 3 со шнеком 7 и вертикального корпуса со шнеком 10. Загрузка свежей культуры осуществляется через дозатор 15; экстрагент подается через течку 13 и поступает сначала в вертикальный корпус, затем переходит в горизонтальный корпус вплоть до ситового пояса 2, из которого и происходит отбор экстракта из грибной поверхностной культуры, т. е. поток экстрагента находится в состоянии противотока с культурой микроорганизма.

Определенный интерес представляет для ферментной промышленности экстрактор непрерывного действия фирмы «Ниро Атомайзер» (Япония), работающий под избыточным давлением (рис. 1.49). Экстрактор представляет собой наклонную цилиндрическую емкость, снабженную двумя шнеками, теплообменными рубашками и насосами. Культура через дозирующее устройство 5 подается внутрь цилиндра, а с противоположной стороны вводится растворитель (вода). Экстракт выходит из установки через самоочищающийся фильтр, а биошрот удаляется с противоположного конца. В случае необходимости, если ферменты экстрагируются неполностью, можно осуществлять двухступенчатое экстрагирование, увеличивая длительность процесса. Вторичный экстракт может быть использован в качестве растворителя для первой ступени экстрагирования. Общая продолжительность экстрагирования регулируется частотой вращения шнеков. Вторичный биошрот используется как компонент среды или после обеспложивания в кормопроизводстве.

В ферментной промышленности используются экстракторы роторного типа фирмы «Роунс Дауне», состоящие из неподвижного корпуса, внутри которого находится ротор, разделенный на 16-20 секторных отсеков, вращающийся вокруг вертикальной оси. Каждый отсек имеет ситчатое дно, на которое подается измельченная культура гриба. Ротор медленно вращается и последовательно проходит четыре участка, в каждом из которых культура смачивается водой или экстрагентом из предыдущих отсеков, вытяжка отсасывается вакуум-насосом и подается в следующий отсек для увлажнения свежей культуры, вновь отбирается вытяжка и передается в 3-й отсек и т. д. При завершении одного оборота ротора биошрот разгружается, и отсеки вновь загружаются свежей культурой.

В настоящее время наблюдается тенденция к более широкому использованию пресс-диффузии. Она заключается в том, что культура после настаивания с водой отпрессовывается, затем снова настаивается при меньшей концентрации ферментов в получаемом экстрагенте, вновь прессуется и т. д. Вероятно, после удачного аппаратурного решения данного принципа он найдет широкое применение в ферментной промышленности.