Классификация питательных сред

Питательные среды различают по происхождению, консистенции, и назначению.

По происхождению питательные среды делят на естественные и искусственные. Естественные среды готовят из молока, мяса, яиц, картофеля, сыворотки крови человека, животных и других продуктов. В практической бактериологии чаще используют искусственные питательные среды, представляющие собой сбалансированные смеси питательных веществ в концентрациях и сочетаниях, необходимых для роста и размножения микроорганизмов. В них в качестве универсального источника азота и углерода используют пептоны – продукты неполного расщепления белков с помощью пепсина или различные гидролизаты (рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.).

По консистенции питательные среды бывают жидкие, полужидкие и твердые. Жидкие среды готовят на основе водных растворов каких-либо веществ, как правило, мясной воды. Для получения плотных сред к жидким добавляют уплотнители, чаще всего агар-агар (рисунок 4,5). Он представляет собой полисахарид сложного состава, имеющий волокнистую структуру, получаемый из морских водорослей. Агар-агар плавится при температуре около 90 °С и затвердевает при температуре около 40 °С. Полужидкие среды имеют вязкую консистенцию благодаря добавлению к ним небольшого количества агар-агара (0,3-0,7 %). В плотных средах концентрация агар-агара составляет 1,5–3,0 %.

Рис.4 Водоросли Gracilaria и Gelidium два основных источника для коммерческого производства агара

Рис.5 Сухие пластины агар-агар. Плавится при t 80–100 °С, застывает при t 37–40 °С

По назначению питательные среды делятся на следующие категории.

1.Основные (универсальные) – среды, на которых хорошо растут многие виды бактерий. К ним относятся мясо–пептонный бульон (МПБ) и мясо-пептонный агар (МПА) (рисунок 6). МПБ готовят на основе мясной воды с добавлением 1% пептона и 0,9% NaCl. Для получения МПА к мясо-пептонному бульону добавляют 1,5-3% агар-агара.

Рис.6. Мясопептонный агар в чашке Петри (МПА) и мясопептонный бульон в пробирке (МПБ)

2.Специальные среды используют для получения роста прихотливых бактерий, не растущих или очень плохо растущих на основных питательных средах. Специальные питательные среды (кровяные, сывороточные, асцитические, сахарные и т.д.) приготавливают путем добавления к МПБ или МПА крови (5–10%), сыворотки (10–20%), асцитической жидкости (25–30%), углеводов (0,5–1,0%), глицерина (2–5%).

Кровяной агар используют для выделения стрептококков (рисунок 7), сывороточный – для получения роста менингококков и гонококков. На среде Борде – Жангу выделяют бордетеллы (возбудителей коклюша и паракоклюша) (рисунок 8), на среде Левенштейна – Йенсена – микобактерии (рисунок 9).

К специальным тканевым средам относят среду Китта–Тароцци и среду Аристовского–Гельтцера. Эти среды применяют для культивирования анаэробных бактерий.

Среда Китта–Тароцци содержит мясо–пептонный бульон, 0,5% глюкозы и кусочки печени или мясного фарша (рисунок 10).

Рис. 7 Кровяной агар

Рис. 8 Среда Борде – Жангу с ростом

Среда Аристовского-Гельтцера состоит из кроличьей сыворотки и кусочков мозга кролика. Перед посевом среды прогревают в водяной бане в течение 10–15 минут для удаления воздуха. После посева среды заливают слоем вазелинового масла или парафина с целью изоляции от атмосферного воздуха.

Рис. 9 Среда Левенштейна–Йенсена с ростом и без

Рис.10 Среда Китта–Тароцци

3.Элективные среды предназначены для избирательного выделения и накопления микробов определенного вида из материалов, содержащих разнообразную микрофлору. Рост других бактерий на этих средах затруднен. Принцип действия элективных сред основан на:

1. Добавлении веществ, ингибирующих рост сопутствующей микрофлоры.

Например, на среде ЖСА (желточно – солевой агар), содержащий до 9% NaCl, культивируют стафилококки, рост же других бактерий столь высокое содержание соли подавляет (рисунок 11). Пептонную воду (рН – 8,4) используют для выращивания холерного вибриона, т.к. сдвиг рН среды в щелочную сторону не влияет на рост данного вида микроба.

Добавление желчи в среду Раппопорт ингибирует рост большинства бактерий, но не влияет на выделение сальмонелл.

Рис. 11 Желточно – солевой агар с ростом

2. Опережении роста определенного вида микроба по сравнению с сопутствующей микрофлорой. Например, на среде Ру (свернутая лошадиная сыворотка) и среде Леффлера (1 часть лошадиной сыворотки и 3 части сахарного бульона) возбудитель дифтерии образует видимый рост через 4–6 часов, остальные бактерии через 18–24 часа. На 1% пептонной щелочной воде холерный вибрион образует пленку на поверхности через 6-8 часов.

3.Дефицит питательных веществ. Например, 1% пептонная щелочная вода для выделения холерного вибриона

4.Дифференциально-диагностические – среды, позволяющие отличать одни виды бактерий от других по их ферментативной активности.

В состав данных сред входит:

1.Основная питательная среда (МПБ или МПА).

2.Определенный химический субстрат (например, углевод), различное отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроба.

3.Индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о биохимической реакции.

К дифференциально–диагностическим средам относят среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гисса и многие другие.

Среда Эндо состоит из МПА с добавлением 1% лактозы и индикатора (основного фуксина, обесцвеченного сульфитом натрия) (рисунок 12). Свежеприготовленная среда имеет бледно-розовую окраску, так как фуксин в щелочной среде обесцвечивается. При росте бактерий, ферментирующих лактозу, рН среды меняется в кислую сторону, фуксин проявляет свой цвет, колонии окрашиваются в темно-красный цвет с металлическим блеском. Лактозоположительными бактериями являются эшерихии. Бактерии, не ферементриующие лактозу, не изменяют рН среды, образуют бесцветные колонии. Лактозоотрицательные бактерии – сальмонеллы и шигеллы.

Среда Плоскирева (содержащая МПА, лактозу и индикатор нейтральный красный) является не только дифференциально-диагностической, но и селективной, так как подавляет рост сопутствующих микробов за счет содержания бриллиантовой зелени, солей желчных кислот и способствует лучшему росту некоторых болезнетворных бактерий (сальмонелл, шигелл), то есть среда Плоскирева является комбинированной средой(рисунок 13).

Рис. 12 Среда Эндо: колонии лактозоотрицательных бактерий (слева) и лактозоположительных (справа)

Рис. 13 Среда Плоскирева колонии лактозоотрицательных бактерий (сверху) и лактозоположительных (снизу)

Среды Гисса состоят из 1% пептонной воды, 0,5% определенного углевода (глюкоза, лактоза, манит и др.) и индикатора Андреде (кислый фуксин в растворе NaOH). В пробирку со средой опускают поплавок (стеклянная трубочка, один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов, образующихся при разложении углеводов. Свежеприготовленная среда имеет слегка желтый оттенок, так как в щелочной среде фуксин обесцвечивается. Бактерии ферментируют углеводы с образованием кислоты, а иногда кислоты и газа. Вследствие ферментации углевода, рН среды в пробирке меняется в кислую сторону, фуксин проявляет свой цвет, среда становится красной. При ферментации углевода с образованием кислоты и газа, появляется также пузырек воздуха в поплавке (рисунок 14,15).

Рис. 14 Среды Гисса до посева

Рис. 15 Изменение цвета сред Гисса после посева и суточной инкубации

5. Комбинированные - питательные среды, обеспечивающие избирательный рост определенных видов бактерий, как элективные питательные среды, в то же время позволяющие выявить биохимические свойства этих бактерий. Такой средой является среда Плоскирева.

6.Синтетические – среды строго определенного состава, представляющие собой растворы неорганических и органических соединений, обеспечивающих азотистое, углеродное и минеральное питание микроорганизмов. Например, среда Сотона для культивирования туберкулезных микобактерий. Среда 199, среда Игла для культуры клеток.

В настоящее время в бактериологических лабораториях широко используют сухие питательные среды, выпускаемые промышленностью. Они представляют собой гигроскопические порошки, растворяющиеся в воде. Данные среды имеют постоянный состав, их просто готовить и удобно транспортировать.